[发明专利]玉麦法呢基焦磷酸合酶基因YFPS及其分离克隆、定点突变及酶功能的检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种参与小麦甲羟戊酸代谢途径中类异戊二烯物质合成的分支点的关键酶基因的分离克隆、基因定点突变、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及酶功能检测技术。

背景技术

类异戊二烯物质是维持植物生长发育、光合作用、电子传递、应对环境胁迫等所必需的重要物质。该类物质可作为光合色素（如叶绿素、类胡萝卜素）、生长物质和植物激素（如细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯）、膜结构的一部分如谷甾醇、电子传递受体如质体醌、作为葡萄糖基化反应中葡萄糖的受体如多萜醇，并能调控细胞的生长（如异戊烯基蛋白，细胞分裂素）。此外，很多植物类异戊二烯还具有重要的商业价值如橡胶、食物香料、饮料、维生素A、D、E以及天然杀虫剂如除虫菊素等。

类异戊二烯物质主要通过甲羟戊酸途径中的一系列酶催化合成的，其中该代谢途径中分支点的关键酶是法呢基焦磷酸合酶（FPS;EC2.5.1.1/EC2.5.1.10），是控制整个代谢途径的限速酶之一。该酶将一个分子的异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）通过1'-4顺序进行缩合，首先形成牻牛儿基焦磷酸（GPP），然后与另一分子异戊烯焦磷酸缩合形成一个多分支点的、特别重要的中间产物法呢基焦磷酸（FPP）。目前已分别从拟南芥（Arabidopsisthaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、高粱（Sorghum bicolor）、橡胶（Heveabrasiliensis）等40种植物中分离克隆了法呢基焦磷酸合酶基因，在本发明申请之前，还没有公开或发表过关于从小麦地方品种“玉麦”中分离克隆法呢基焦磷酸合酶基因、基因定点突变、基因原核表达、酶蛋白的分离纯化及其酶功能体外检测等研究资料信息。特别是对于野生型玉麦法呢基焦磷酸合酶基因进行定点突变的研究，现在还是空白，无法应用基因突变技术获得更好的效果。

发明内容

针对现有技术中在小麦法呢基焦磷酸合酶基因相关技术的缺失，本发明的发明人提供了一整套关于小麦地方品种“玉麦”法呢基焦磷酸合酶基因克隆、基因定点突变、基因原核表达、高纯度酶蛋白的分离纯化及酶功能检测技术。测得自小麦地方品种玉麦克隆获得的野生型法呢基焦磷酸合酶对底物二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）、异戊烯焦磷酸（IPP）和牻牛儿基焦磷酸（GPP）的Vmax分别为10.0±0.6、31.2±0.8和23.3±0.8mol/min/mg；KM值分别为0.80±0.12、0.71±0.04和0.76±0.06μM；Kcat分别为0.23±0.01、0.72±0.02和0.54±0.02S-1，Kcat/KM分别为2.88x105、1.01x106和7.11x105M-1S-1，由此证明克隆的野生型玉麦法呢基焦磷酸合酶基因具有天然生物学功能。测得玉麦法呢基焦磷酸合酶突变体H278L对底物二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）、异戊烯焦磷酸（IPP）和牻牛儿基焦磷酸（GPP）的Vmax分别为16.1±1.4、46.3±2.8和41.9±6.3mol/min/mg；KM值分别为2.31±0.35、1.52±0.19和2.27±0.62μM；Kcat分别为0.88±0.08、2.53±0.15和2.29±0.34S-1，Kcat/KM分别为3.81x105、1.66x106和1.01x106M-1S-1；测得玉麦法呢基焦磷酸合酶突变体D295E对底物二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）、异戊烯焦磷酸（IPP）和牻牛儿基焦磷酸（GPP）的Vmax分别为32.6±2.1、76.3±0.8和70.9±9.5mol/min/mg；KM值分别为2.14±0.25、0.46±0.02和2.15±0.51μM；Kcat分别为2.55±0.16、5.97±0.06和5.54±0.74S-1，Kcat/KM分别为1.19x106、1.30x107和2.58x106M-1S-1，表明通过对氨基酸密码子的改变，能够提高酶的催化活性，其中替换的谷氨酸（E）残基对酶活性的提高较为显著。本发明为进一步进行基因改造和修饰、构建法呢基焦磷酸合酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨法呢基焦磷酸合酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、作物籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对法呢基焦磷酸合酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。

本发明提供的玉麦法呢基焦磷酸合酶基因YFPS的编码区基因序列如Seq ID No:1所示，其编码的氨基酸序列如Seq ID No:2所示。