[发明专利]一种产黄青霉菌的梯度高浓度青霉素培养基选育法

说明书

摘要

本发明涉及一种产黄青霉菌菌种的优选方法，具体是，将普通工业生产用产黄青霉菌菌株从米孢子出发，经调配溶液、梯度高浓度青霉素平板培养基筛选、复筛、验证而获得耐受性好的高产菌株。采用梯度高浓度青霉素培养基筛选的菌株的方法，开辟了工业发酵生产用产黄青霉菌的优选的新途径。该方法操作简便，所用仪器设备少，成本低廉，效率高，易于工业生产推广应用。

技术领域

本发明属于工业发酵生产用产黄青霉菌的高产菌株优选，特别涉及的是一种用含梯度高浓度的青霉素的PDA培养基诱变筛选普通菌株，从而获得高产菌株的方法。

背景技术

青霉素作为我国两大战略性原料药品之一，不仅是人们健康生活的保障，同时也对我国在世界药品市场的地位有重要的影响。 

我国青霉素工业菌种的发酵能力，发酵指数和生产成本与国外企业相比还有很大差距，国外工业菌株发酵能力约是我国的1.8倍，其发酵成本仅占售价的25%，而我国发酵产品的生产成本占到售价的50%—60%。这使得我国发酵产品的利润空间和发酵工业的赢利能力远低于国外同类企业。我国更多是以规模生产在国际市场参与竞争。 

青霉素的技术创新势在必行。而在技术创新中，优良菌株的选育工作是其中的重要组成部分，一个耐受性好的高产菌株可以直接提高发酵效率，带来巨大的经济效益。

 

发明内容

本发明的目的是提供一种廉价高效的产黄青霉菌菌种的优选方法，具体是，将普通工业生产用产黄青霉菌菌株从米孢子出发，经调配溶液、梯度高浓度青霉素平板培养基筛选、复筛、验证而获得耐受性好的高产菌株。

本发明的技术方案是：将工业发酵用米孢子的悬浊液，涂布在含有高浓度梯度青霉素的PDA培养基上诱变并初筛，在培养箱中培养，以菌落的形态为特征选出优良菌株，然后再用含青霉素的PDA平板复筛，选出表现优良的菌株，接种到摇瓶中微量发酵，以效价为特征选出优良高产菌株。

米孢子是工业发酵生产接种用的小米孢子。米孢子悬浊液是将工业发酵用米孢子用灭菌水洗脱，制成1×10⁶ ~1×10⁷个孢子/cm³的悬浊液。在无菌工作台上，将稀释好的悬浊液涂布在含青霉素浓度分别为：50~60mg/ml，60~70mg/ml，70~80mg/ml，80~90mg/ml，90~100mg/ml，100~110mg/ml的PDA平板培养基上，每个浓度四个培养皿。然在培养箱中遮光，25℃培养7~9天观察菌落的特征和形态。 

菌落呈圆台型突起、突起布满褶皱、褶皱厚实均匀、颜色呈灰绿色、突起高且粗壮的为待验证的菌株，选取靠近高浓度的一端的涂布12个平板，一般每个平板上会有3~6个符合要求的菌株，把这些菌株全部挑出、编号、接种到含青霉素60~70mg/ml的PDA平板培养基上进行复筛，同样在培养箱中25℃静置培养。6天后，最符合上述优良菌落特征的菌株挑出、编号，进一步验证，将挑出的菌株接种到10ml试管培养基中，在摇床上25℃，摇床200转/分钟，培养56小时，再转接到装有30ml培养基的250ml摇瓶中，摇床上26℃，摇床200转/分钟继续培养6天，每天补加2ml浓度为30%的苯乙酸灭菌溶液。

用培养六天后的发酵液，测青霉素的效价，效价在3×10⁴IU/ml以上的即为优良高产菌株。

本发明的优点是：

1、采用含特定梯度浓度青霉素的PDA培养基诱变育种，效率高，操作程序简便，所用仪器设备少，成本低，是一种易于推广的青霉菌育种方法。

2、复筛和验证保证了诱变后新菌株的耐受性和稳定性，高产效果明显，在不到一个月的时间里选育到2株新菌株，效价增产分别为9%和12%，经济效益显著。

具体实施方式：

实施例1：