[发明专利]一种金钱松细胞的悬浮培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种金钱松的组织培养方法，特别是涉及一种金钱松细胞的悬浮培养方法。

背景技术

金钱松是我国特有的古老孑遗松科树种。根据世界保护联盟(IUCN)新制定的物种受威胁的分类系统标准和中国植物红皮书的标准，金钱松被定为渐危种，并被列为国家二级保护植物。

金钱松既是重要的园林植物，同时更是一种重要的、应用前景广阔的药用植物。研究发现，金钱松最主要的药用成分是从其树皮和根皮中提取出来的二萜类化合物土槿酸，它具有抗肿瘤、抗真菌、抗早孕和使胆囊自截等功效，尤其是抗肿瘤的功效使得金钱松的药用价值更加凸显。现代药理研究发现，土槿酸及其衍生物能作用于多种癌细胞如胃癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞等，并具有明显的量效关系。

目前金钱松人工种植主要采用有性繁殖和无性繁殖两种方式。有性繁殖即种子繁殖，由于金钱松存在结实率低、结实间隔期较长（一般3～5年结实）、采种条件苛刻（采种母树年龄以100年左右为最好）、种子成活率低（仅为60%-70%）、以及种子需低温保存等因素的限制，因此目前还不可能通过有性繁殖大量种植金钱松。无性繁殖即扦插繁殖，金钱松为菌根性树种，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地或在土内有菌的林间育苗，植物生长周期长，并易受金钱松小卷蛾的严重危害，这些因素限制了金钱松的大量无性繁殖。由于人工种植金钱松存在上述问题，因此目前迫切需要利用组织培养技术来大量生产有效成分含量高的金钱松培养物，以满足人们对金钱松的需要。

目前金钱松的研究主要集中在对金钱松有效成分的提取及其内生真菌的筛选方面，极少有金钱松在植物生物技术方面研究的报道。已有的金钱松在植物生物技术方面的研究，如：王跃华等人发明的“一种以金钱松叶原基为外植体的愈伤组织培养方法”（专利申请号：201210104866.8），也只对金钱松愈伤组织的培养进行了研究。目前还未见任何有关金钱松细胞在悬浮培养方面的研究报道。

发明内容

本发明的目的是针对目前金钱松资源紧缺以及现有传统栽培方法存在周期长、难度大的问题而提供一种金钱松细胞的悬浮培养方法，该方法可实现在短时间内快速生产出有效成分含量高的金钱松细胞培养物，以缓解当前金钱松植物资源紧缺的问题。

为达到上述目的，本发明采用的解决方案由如下步骤构成：

（1）愈伤组织的诱导培养：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽进行消毒处理，再将已消毒的芽接入固体培养基MS+6-BA1.0～2.0 mg·L^-1+NAA0.5～4.0 mg·L^-1 +蔗糖20～50 g·L^-1 +琼脂5.0～7.0 g·L^-1中进行培养，培养温度10～30 °C、pH值为5.6～6.5、每天光照4～16小时、光照强度为1000～2000 lx；

（2）细胞的预培养：将步骤（1）中获得的愈伤组织转接入液体培养基MS+6-BA0.5～1.5 mg·L^-1+2、4-D 1.0～4.0 mg·L^-1+KT 0～2.0 mg·L^-1+蔗糖20～50 g·L^-1 中进行5～8天的预培养；

（3）细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的金钱松单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50 g·L^-1的接种量转接到B5+6-BA0.1～1.0 mg·L^-1+2、4-D 2.0～5.0 mg·L^-1+KT 0.1～1.0 mg·L^-1+蔗糖20～50 g·L^-1的液体培养基中进行细胞的悬浮培养；

（4）细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了30天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；

（5）细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10 min后，倒掉上清液进行称重，即为鲜重；

细胞增殖倍数=（收获量鲜重—接种量鲜重）/接种量鲜重；

细胞的生长速率（即每升培养液中每天生长量）=（收获鲜重—接种量鲜重）/培养天数。