[发明专利]家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用及其重组载体

说明书

 

技术领域                         

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用，还涉及含有家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体和制备方法。

背景技术

家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物，在我国已经有5000多年的饲养和驯化历史。蚕丝业是许多地区农民的主要经济收入来源之一，为世界经济、文化、社会发展做出了重要贡献。但是，当家蚕遭遇病毒侵害的时候，通常会对蚕丝业造成巨大的损失。据统计，我国养蚕的几个主产区，每年因病毒性疾病所造成的损失，约占蚕病总损失的70-80%。其中家蚕核型多角体病毒病是三大病毒病中最常见、危害最为严重的一种，该病传染性强，难以控制。

引起核型多角体病毒病的病原为家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear Polyhedrosis Virus，BmNPV)。 BmNPV属于杆状病毒科，真杆状病毒亚科，核型多角体病毒属，病毒粒子呈杆状，全基因组大小为128413bp。病毒结构主要由外层的囊膜和内层的核衣壳组成，在不同感染时期分别以出芽型病毒粒子(budded virus，BV)和包埋型病毒粒子(occluded virus, ODV)两种形态存在，而多角体是在感染细胞的核或质中产生的包含和保护病毒粒子的一种蛋白质结晶，很稳定。多角体病毒对不良环境、消毒药剂等有较强的抵抗性，在环境中可以长期存活，但极易溶于碱性溶液。BmNPV主要通过经口食下感染家蚕，当家蚕食下多角体病毒，在中肠强碱性消化液(pH9.2~9.4)作用下，多角体被溶解，释放的病毒粒子ODV借囊膜与中肠上皮细胞微绒毛膜的融合作用脱去囊膜，核衣壳进入中肠细胞开始原发感染(Primary infection)，在细胞内复制核衣壳并通过“出芽”方式产生BV进入血体腔，继而感染其他组织细胞。最终，蚕体多以体壁破裂，流出病毒多角体浓汁而死。病毒多角体浓汁中含有大量的病毒粒子，污染蚕座环境，使得周围健康蚕感染病毒。可见，家蚕核型多角体病毒病是蚕业生产中的一个重要的危害原，一旦产生，极易爆发。

由于家蚕核型多角体病毒病在蚕业生产中危害严重，蚕业界一直希望能够培育出对此病毒具有较高抗性的蚕品种。但是，由于目前病毒致病分子机制研究较少，加之主要通过传统的方法进行遗传筛选，周期长而且定向性差，所以收效甚微。

转基因技术在生物素材创新、现代遗传育种等方面发挥着重要的作用。自2000年日本科学家报道首次成功培育转基因家蚕以来，国内外已陆续报道转基因家蚕成功的消息。2007年，印度学者报道通过转基因干涉病毒基因的方法来提高家蚕的抗性，他们利用的是家蚕多化性品系的非滞育卵，主要是因为多化性家蚕品种所产的卵为生种卵，其不需要任何的人工处理便能够在适当的温湿度下连续发育直至孵化，这个特点极大地方便了转基因实验中的操作控制。但是，通过转基因干涉利用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系具有以下两个方面明显的缺陷：①生产用种普遍为二化性滞育种，用多化性家蚕品种制备的抗病毒品系不利于生产推广，同时与滞育性的家蚕品种相比较，多化性家蚕品种不具有滞育期，对其继代维持只能依靠连续的饲养繁殖，这样需要耗费大量的人力物力对获得的转基因家蚕品系进行维持和继代，同时也大大增加了获得的转基因家蚕品种资源丢失的风险。②转基因干涉品系只能在病毒入侵后抑制病毒的复制增殖，不能在病毒侵染的其他阶段发挥作用。因此，利用家蚕滞育品种，制备一种能在BmNPV病毒侵染的多个阶段发挥抑制作用的转基因品系是一个制备高抗病毒品种的有效方法。

在前期研究中，我们制备了增量表达家蚕内源抗性基因Bmlipase-1的转基因品系，检测结果显示该品系能显著提高家蚕对BmNPV的抵抗力。Bmlipase-1在家蚕中肠特异表达，然后分泌到家蚕肠液中发挥作用，该蛋白在肠液中能够抑制灭活BmNPV病毒，减少侵入家蚕中肠细胞的ODV病毒数量，从而提高家蚕对BmNPV的抗性，但是抗性提高有限。

发明内容

本发明的目的之一在于提供家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的应用；本发明的目的之二在于提供含有家蚕核型多角体病毒多基因反向重复序列和家蚕脂肪酶1基因的重组载体；本发明的目的之三在于提供重组载体的制备方法。