[发明专利]一种α-熊果苷生产过程中蔗糖磷酸化酶的回收方法

说明书

技术领域

本发明属于生物化工领域，涉及一种α-熊果苷生产过程中蔗糖磷酸化酶的回收方法。

背景技术

熊果苷是一种氢醌的葡萄糖苷衍生物，首次发现于熊果属的植物叶子中。熊果苷具有镇咳、祛痰、抗炎、抗菌等生理活性，因而被用作镇咳药物和尿道消毒剂等使用。更为重要的是，熊果苷能够抑制酪氨酸酶的活性，从而遏制黑色素的生长，因此可以作为一种美白成分添加于化妆品中。熊果苷有两种异构体：α-熊果苷和β-熊果苷。其中，α-熊果苷的结构比β-熊果苷更稳定，美白效果是β-熊果苷10倍以上，并且对表皮细胞的正常生长没有影响，具有稳定、有效、安全的特点，因此α-熊果苷是21世纪最有竞争力的美白添加剂之一。

α-熊果苷与β-熊果苷的来源有所不同，β-熊果苷可以通过植物提取、植物细胞培养、有机合成以及糖基转移酶或糖苷酶的转糖基反应或逆水解反应获得。，而α-熊果苷一般只能通过微生物直接转化或或微生物的酶催化转糖基反应获得。但通过微生物直接转化制备熊果苷的产率较低，而糖苷酶的价格昂贵，只适于实验室制备，都不适用于工业化大规模生产α-熊果苷。因而较低成本的获得高酶活的糖苷酶对于生产催化合成α-熊果苷十分必要。

专利201110009399.6公开了一株表达重组蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌，利用该菌发酵可以生成高酶活的蔗糖磷酸化酶，并且利用该酶催化蔗糖和氢醌进行转糖基反应可以大量生产α-熊果苷，生产成本相对于直接利用糖苷酶低。此外由于整个酶催化反应的条件温和，反应时间短，所以反应结束后，反应液中蔗糖磷酸化酶的酶活仍然较高。因此回收并重复利用蔗糖磷酸化酶，可以进一步降低生产成本。

固定化蔗糖磷酸化酶可以重复利用，这可以在一定程度上降低酶的使用成 成本较高。但整个酶的固定化成本也比较高，包括酶的分离纯化成本及固定化成本。因此直接利用非固定的即游离的蔗糖磷酸化酶作为催化剂，可有效地省去酶的分离、纯化、固定化等过程，大大降低酶的制备成本。在利用游离的蔗糖磷酸化酶催化合成α-熊果苷的过程中，能否实现非固定化蔗糖磷酸化酶的多次回收利用是降低酶成本的关键，也是游离蔗糖磷酸化酶能否应用于工业化生产α-熊果苷的制约因素。

发明内容

本发明的目的在于提供一种α-熊果苷生产过程中蔗糖磷酸化酶的回收方法，有效地解决游离蔗糖磷酸化酶的回收利用，使得蔗糖磷酸化酶的使用成本显著降低，对于游离蔗糖磷酸化酶应用于酶催化领域有着重大的意义。

本发明以蔗糖和氢醌为底物，利用游离蔗糖磷酸化酶粗酶液作为催化剂催化生产α-熊果苷，反应结束后，利用膜分离方法进行游离蔗糖磷酸化酶的回收，再利用回收的蔗糖磷酸化酶进行下一批次的催化反应。

本发明中，利用游离的蔗糖磷酸化酶粗酶液作为催化剂催化合成α-熊果苷可以采用现有技术公开的任一种技术方案，作为本发明的最佳实施方式，优选合成过程为：加入浓度为20-50% (w/v) 的蔗糖，浓度为1-5% (w/v)的氢醌，酶活为100-300 U/mL的蔗糖磷酸化酶粗酶液，反应pH为6-7， 反应温度为20-40 ℃，轻微搅拌，反应20-30h后，氢醌的转化率可达到90%，更优选合成过程为：将浓度为20% (w/v) 的蔗糖，浓度为:2% (w/v) 的氢醌，酶活为200U/mL的蔗糖磷酸化酶酶液置于反应器中，调节pH 至6， 反应温度为35 ℃，轻微搅拌，反应24h。。

上述合成反应结束后，首先加入浓度为1%-10%（w/v）的稳定添加剂，然后利用陶瓷膜过滤除去不溶性的絮状物质以及一些大分子蛋白，再利用孔径较小的超滤膜进行游离蔗糖磷酸化酶的回收。该超滤回收过程中，α-熊果苷作为滤出液滤出，收集处理后可得合成产物α-熊果苷。

本发明所述的蔗糖磷酸化酶的回收方法，蔗糖磷酸化酶的回收率达到95%以上，回收的酶液中残留的反应物以及产物均小于5%。最后利用回收的蔗糖磷酸化酶进行下一批次的催化合成α-熊果苷，除了不需要另外添加酶液以外，其他反应条件与前一批次相同，这样可以达到反复使用蔗糖磷酸化酶的目的。如此进行5个批次反应后，回收的蔗糖磷酸化酶的活性还可以保持在初始酶活的85%以上。

本发明所述蔗糖磷酸化酶为游离的蔗糖磷酸化酶粗酶液，理论上所述的蔗糖磷酸化酶可以来源于多种菌株，为实现更好的回收效果，本发明优先考虑大肠杆菌sp1515，该酶在催化反应结束之后仍然具有较高的酶活力。