[发明专利]一组特异识别玉米赤霉烯酮的寡核苷酸适配子

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备的一组特异性高亲和力结合玉米赤霉烯酮的寡核苷酸适配子，为快速分离富集或分析检测玉米赤霉烯酮奠定了基础。

背景技术

玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN，又称F-2毒素)是由禾谷镰刀菌、粉红镰刀菌、尖孢镰刀菌、三线镰刀菌、串珠镰刀菌、黄色镰刀菌以及雪腐镰刀菌等菌种产生的次级代谢产物，是一种雌激素真菌毒素。主要存在于玉米和玉米制品中，小麦、大麦、高粱、大米中也有一定程度的分布。玉米赤霉烯酮具有较强的生殖毒性和致畸作用，可引起动物雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对家禽特别是猪、牛和羊的影响较大，给畜牧业带来了很大的经济损失。玉米赤霉烯酮也可通过被污染的谷物和肉、奶等制品进入人体，其对人体的毒害主要为生殖发育毒性、免疫毒性、肝毒性，同时对肿瘤的发生还有一定的影响，如易发生子宫癌、乳腺癌等。鉴于ZEN的易感性，而大多数农场或企业不能有效地进行ZEN地监督和检测工作，因此寻找一种经济、快捷、准确并且易于普及推广的ZEN检测方法显得尤为迫切。

目前，检测玉米赤霉烯酮方法主要有薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效液相质谱联用法(HPLC-MS)，微生物检测法和免疫检测法等。薄层层析法操作简单，适合于没有经过专门培训的人员操作，且成本低，无需价格昂贵的仪器；但其步骤较繁琐，灵敏度低。HPLC法准确度高，灵敏度性强，可作为定量检测方法，但是所用仪器设备较为昂贵，样品前处理方法复杂，不利于大量样品的快速检测。依赖抗体的免疫学检测法具有灵敏度高，适用于检测大量样品，无需大型昂贵仪器设备的优点；但是ZEN作为一种分子量318.4的小分子物质，不具备免疫原性，需将其与大分子体蛋白结合制备完全抗原后才能刺激动物分泌抗体。这个过程不仅繁琐耗时而且成本昂贵，而且制得的抗体批次间稳定性不如寡核苷酸，抗体的储存条件也较寡核苷酸严苛。

近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，系统进化指数富集技术)是20世纪90年代发展起来的一种新的组合化学技术，具有经济、简便、快速、适用范围广等特点。SELEX技术利用分子生物学技术，构建人工合成的随机寡核苷酸文库，其中随机序列长度一般在20-40nt左右，两端引物序列一般在20nt左右，文库容量大约在10¹³-10¹⁵范围内。由于单链寡核苷酸随机序列，容易凸环、发卡、假节、G-四聚体等二级结构，故能与蛋白质、肽段、药物、氨基酸、有机化合物，甚至是金属离子相结合，形成很强结合力的复合体。

至今已通过SELEX技术筛选到赭曲霉毒素、伏马毒素B1等真菌毒素小分子的寡核苷酸适配子，并建立了一系列基于寡核苷酸适配子的新型检测方法；但目前尚无有关玉米赤霉烯酮寡核苷酸适配子及其制备方法和应用的研究报道。本发明以食品或饲料中常见的玉米赤霉烯酮为靶标，利用竞争SELEX技术制备获得了与玉米赤霉烯酮高特异性高亲和力结合的寡核苷酸适配子。该寡核苷酸适配子经修饰后可直接用于荧光或化学发光、发色方法检测玉米赤霉烯酮以丰富实验室检测手段，也可用于开发试纸条或便携式小型仪器以实现家庭、农田、工厂快速检测，因此该发明可以在食品安全检测领域得到广泛应用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能与玉米赤霉烯酮特异性结合的寡核苷酸适配子并用于快速、准确检测ZEN，为开发新型ZEN分析方法或检测工具奠定良好基础。

本发明方法利用指数级富集配体的系统进化技术(SELEX技术)，以玉米赤霉烯酮为靶标，筛选获得与靶标高亲和性特异结合的寡核苷酸适配子以达到快速、准确诊断食品或粮食中玉米赤霉烯酮的目的。

本发明的优点是：

(1)获得了能与玉米赤霉烯酮高亲和力、高特异性结合的寡核苷酸适配子，该寡核苷酸适配子可以大量人工制备、稳定性好，制备方法简单、成本低廉，相对于抗体的优势显而易见。

(2)该序列是从结构显著、与靶标具有不同亲和力的12条寡核苷酸适配子序列中选取出的亲和力和特异性均最强的一组寡核苷酸适配子序列，能够特异识别玉米赤霉烯酮。

附图说明

图1是5Z、8Z及11Z寡核苷酸适配子的饱和结合曲线图；