[发明专利]利用一种融合标签提高外源蛋白质的表达量

说明书

技术领域

本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中提高外源蛋白质表达量的新方法。更特殊地涉及枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Hag50)作为融合标签来实现外源蛋白质的过量表达。 

背景技术

大肠杆菌一直是表达外源蛋白的首选表达系统.但由于外源蛋白在表达过程中容易被宿主细胞蛋白酶降解或者形成包涵体，而且大肠杆菌那样具有热源性脂多糖，其应用受到了限制.由于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的遗传学背景清楚，而且是一种食品级微生物，所以近年来枯草芽孢杆菌作为外源基因表达的宿主发展迅速并展现出良好的工业应用前景。虽然主要利用枯草芽孢杆菌实现外源蛋白质的分泌表达，但是在枯草芽孢杆菌中成功胞内表达的例子也很多(Zweers JC，Barak I，Dorte B，et al.Micro Cell Fact，2008，7：10)。绿色荧光蛋白质(Green Fluorescent Protein，GFP)广泛应用于报告蛋白、融合标记、蛋白质定位等领域。GFP作为一种新型的定量检测手段，已经广泛的应用到生物技术的各个方面。 

蛋白质的表达量一直是科研工作者关心的重点。通过优化启动子和核糖体结合位点，共表达分子伴侣，降低蛋白酶表达量，优化编码基因的密码子等手段能明显的提高外源蛋白质的表达量。但是对于一些外源蛋白质，虽然通过以上优化表达量仍然很低或者达不到工业化生产的要求。所以，发现新的能提高外源蛋白质表达量的方法尤为重要。本发明是以GFP为报告蛋白质，通过N端融合Hag标签而尝试提高GFP的表达量。 

发明内容

本发明的目的通过融合分子标签Hag50(Hag的前50个氨基酸)，提高报告蛋白质GFP的表达量。 

本发明所采用的技术方案是： 

枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Hag50)作为融合标签提高外源蛋白质的表达量。具体的，是利用枯草芽孢杆菌鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Hag50)编码基因hag50为分子标签，与外源目的蛋白基因的编码序列(GFP)进行融合，构建能够融合表达重组蛋白的质粒，并转化枯草芽孢杆菌得到枯草芽孢杆菌重组菌株，从而实现融合蛋白质的表达。本发明选择鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Genbank序列号：M26948)作为融合标签，选择易检测和表达毒性低的GFP为外源基因，以具有转化能力且遗传学特性清楚的枯草芽孢杆菌菌株作为重组质粒的转化菌株，如Bacillus subtilis 168及其衍生菌株。 

本发明涉及鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸(Hag50)，将该片段的编码基因与外源目的蛋白基因的编码序列融合后构建成重组质粒pMA5-Hag50-GFP，该质粒中含有强启动子HpaII、Hag50的编码基因以及外源目的蛋白基因(GFP)，它可在枯草芽孢杆菌中表达融合蛋白。 

本发明涉及的构建的融合表达重组蛋白的重组质粒转化枯草芽孢杆菌后得到的重组菌株，组成型的表达外源目的蛋白GFP，可通过荧光光谱仪检测重组蛋白GFP的荧光强弱。本发明中的空白对照是把GFP基因直接连接到质粒pMA5上，构成重组质粒pMA5-GFP。荧光检测采用日立F-7000型荧光光谱仪，检测时的激发波长是488nm，发射波长是547nm。荧光强弱用“相对荧光强度单位”表示。 

本发明涉及鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸编码序列Hag50扩增的引物序列： 

hag-F：AGTGCATATGAGAATTA ACCACA ATATTGC 

hag50-R：CTGGAATTCTTCAGAGATCGCAAGACCTG 

与本领域已知的方法相比，本发明是利用鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸作为融合标签提高外源蛋白质在细胞内的表达水平。与对照相比，融合后的GFP表达量提高了12倍。 

附图说明

图1融合表达Hag50-GFP重组质粒pMA5-Hag50-GFP构建流程图。Amp和bla表示氨苄青霉素抗性基因，用于筛选大肠杆菌转化子，并用来扩增质粒用。Hag50-GFP为鞭毛蛋白Hag的前50个氨基酸编码片段与绿色荧光蛋白GFP基因的融合片段，Promoter HpaII是组成型强启动子HpaII；ori为大肠杆菌复制子。 

图2对照重组质粒pMA5-GFP构建示意图。直接把GFP基因连接到载体pMA5上而构成质粒pMA5-GFP。