[发明专利]一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体的说是一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法。

技术背景

衣康酸是一种重要的化工产品，被美国能源部认为是十二个重要高附加值化学品之一，主要用于腈纶化纤、树脂、橡胶、涂料、造纸、医药、农药、轻工、食品、丝绸等领域。目前国内外所有深层发酵生产衣康酸的工厂都采用土曲霉。如图1所示，在土曲霉中衣康酸的代谢途径是由三羧酸循环分流出来的，三羧酸循环中的顺乌头酸在顺乌头酸脱羧酶(cis-aconitic acid decarboxylase,CAD)的催化作用下脱羧形成衣康酸（Kanamasa,S.，Dwiarti,L.，Okabe,M.，Park E.Y.,Cloning andfunctional characterization of the cis-aconitic acid decarboxylase(CAD)gene from Aspergillus terreus.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2008,80,223-229）。Li等对土曲霉在高产和低产衣康酸两种条件下的基因转录差异进行了比较分析，发现翻译成顺乌头酸脱羧酶的cad基因在高产衣康酸条件下的转录水平显著提高（Li,A.,van Luijk,N.,Beek,M.,Caspers,M.,Punt,P.,van der Werf,M.,A clone-basedtranscriptomics approach for the identification of genes relevantfor itaconic acid production in Aspergillus.Fungal Genet.Biol.，2011,48,602-611），这一实验结果表明，顺乌头酸脱羧酶是衣康酸生物合成途径中的一个关键酶，在土曲霉中提高cad基因的表达水平将有助于提高衣康酸的发酵产量。

关于通过基因工程提高衣康酸发酵产量的研究至今仅有两篇报道。Tevz等通过在土曲霉A156中过量表达6-磷酸果糖激酶突变体解除了针对磷酸果糖激酶的反馈抑制，强化了糖酵解途径，把衣康酸的产量提高了大约2倍，同时发酵周期缩短(Tev,G.,M.,M.,Enhancing itaconic acid production by Aspergillus terreus.Appl.Microbiol.Biotechnol.,2010,87,1657-1664)；Lin等通过在土曲霉NRRL1960中过量表达透明颤菌血红蛋白，提高了菌株对低氧的耐受性，并把衣康酸的发酵产量提高了17%（Lin,Y.H.,Li,Y.F.,Huang,M.C.,Tsai,Y.C.,Intracellular expression of Vitreoscilla hemoglobin inAspergillus terreus to alleviate effect of a short break in aerationduirng culture，Biotechnol.Lett.，2004，26,1067 1072）。但是，关于通过在土曲霉中过表达顺乌头酸脱羧酶提高衣康酸发酵产量的研究，至今未见报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种提高衣康酸发酵产量的菌株及其构建和利用菌株生产衣康酸的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种提高衣康酸发酵产量的菌株，所述菌株为通过基因工程改造在土曲霉中插入乌头酸脱羧酶基因表达盒PgpdAt1-cad-TtrpC得到的重组土曲霉。

提高衣康酸发酵产量的菌株的构建方法，通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉。

利用提高衣康酸发酵产量的菌株生产衣康酸的方法，通过基因工程改造构建顺乌头酸脱羧酶基因表达盒，将其插入土曲霉中得到含有顺乌头酸脱羧酶表达盒的重组土曲霉，过表达顺乌头酸脱羧酶来加强催化顺乌头酸生成衣康酸的反应过程，进而提高衣康酸产量。