[发明专利]三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及泥鳅鳍细胞的体外培养方法，特别是一种操作简单，可用于多倍体鱼类生物学研究、病毒分离扩增、疫苗研制及功能基因研究的三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法。

背景技术

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)在分类学中属于鲤形目(Cypriniformes)、鳅科(Cobitidae)、花鳅亚科(Cobitinae)、泥鳅属(Misgurnus)，是亚洲特有的野生小型淡水鱼类，广泛分布于我国辽河以南大部分地区以及越南、朝鲜和日本。我国各淡水水域，如湖泊、池塘、河溪、水沟、稻田等均有分布。泥鳅肉质细嫩、味美，营养丰富，有“水中人参”之称，除了较高的食用价值，它还具有定的滋补药用功效，是市场上畅销的特种水产品之一。除了具有重要经济价值外，泥鳅还是一种很好的细胞学、遗传学等方面的研究材料。三倍体泥鳅具有生长快、抗性强的特点，三倍体泥鳅鳍细胞可以满足对三倍体泥鳅生物学研究、病毒分离扩增、功能基因研究以及毒理学等应用研究的需要。但是，因为在鱼鳍细胞培养中容易出现微生物污染、细胞易漂浮、体外不易生长等问题，迄今为止还没有关于体外培养三倍体泥鳅鳍细胞的相关报道。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种操作简单、可用于多倍体鱼类生物学研究、病毒分离扩增、疫苗研制及功能基因研究的三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法。

本发明的技术解决方案是：一种三倍体泥鳅鳍细胞的体外培养方法，其特征在于按如下步骤进行：

a．制备细胞培养液

取DMEM/F12培养基，向培养基内分别加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、表皮细胞生长因子和硫酸软骨素制备细胞培养液，其中胎牛血清占总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子浓度为20ng/ml、表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml、硫酸软骨素的浓度为10ug/ml；在4℃的环境下存放；

b.原代培养

在工作台上取三倍体泥鳅的鳍组织，用质量浓度为10%的碘伏浸泡15分钟；再用青霉素和链霉素的混合液浸泡30分钟，青霉素浓度为500IU/ml，链霉素的浓度为500ug/ml；再用PBS漂洗后，于5%FBS-DMEM/F12（pH7.2）中剪成0.8~1.2mm³的块状；经上述处理的鳍组织块均匀接种于25cm²细胞培养瓶中，在25℃CO2培养箱中正置干贴24h后补加培养液至5ml/瓶，启动原代培养至细胞长成单层；

c.  传代培养

吸出培养瓶中的培养液，加入0.25%的胰蛋白酶溶液1ml，5秒钟后吸去胰蛋白酶溶液，使得瓶底形成一层胰蛋白酶膜，消化5min，轻磕细胞培养瓶。将之前吸出的培养液加回，用吸管吹打，制成细胞悬液；将细胞悬液以体积比1:1分到新的两个培养瓶中；向两个培养瓶中补加a步骤所得培养液至5ml；在25℃CO2培养箱中培养至细胞长成单层。

本发明步骤简单，易操作，克服了鱼鳍细胞培养中容易出现微生物污染、细胞漂浮、体外不易生长等问题，所培养的三倍体泥鳅鳍细胞的形态为纤维样，可以连续传代并直接应用于多倍体鱼生物学研究、病毒分离扩增、疫苗研制及功能基因研究。

附图说明

图1是本发明实施例经传10代的三倍体泥鳅鳍细胞镜下图。

图2是本发明实施例所培养的细胞染色体镜下图。

具体实施方式

实施例1：

a. 制备细胞培养液

选择Hyclone公司的DMEM/F12培养基，向培养基内分别加入胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子、I型胰岛素样生长因子、表皮细胞生长因子和硫酸软骨素制备细胞培养液，其中胎牛血清占总体积的20%，人碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10ng/ml，I型胰岛素样生长因子浓度为20ng/ml、表皮细胞生长因子的浓度为10ng/ml、硫酸软骨素的浓度为10ug/ml；在4℃的环境下存放；

b. 原代培养