[发明专利]基于黑麦EST序列的黑麦2R染色体特异的分子标记及其应用

权利要求书

1.基于黑麦EST序列的黑麦2R染色体特异的分子标记，其特征在于：该分子标记为根据黑麦染色体上的表达序列标签EST序列设计的正向引物和反向引物，该分子标记为用于鉴定黑麦2R染色体的特异标记，其名称为2-CGG62，其正向引物序列见SEQ ID NO：3，其反向引物序列见SEQ ID NO：4。

2.应用权利要求1所述的分子标记对小麦背景中的黑麦2R染色体进行鉴定的方法，其特征步骤包括：

A、分子标记的选定和制备：根据权利要求1给出的序列合成此标记引物；

B、标记引物的稀释：将上步合成的标记引物，先用1×TE缓冲液溶解成100μmol L^-1的母液放入-20℃的冰箱中保存，使用前吸取母液用超纯水稀释成10μmol L^-1的工作液待用；其中1×TE缓冲液的配方为，10mmol L^-1Tris-HCl与1mmol L^-1EDTA，pH=8.0；

C、黑麦染色体的特异标记：

C-1、模板DNA的提取：取待测物——小麦与黑麦远缘杂交后代材料，对照物0——不包含待测黑麦染色体的样品，对照物1——包含待测黑麦染色体的样品，然后利用常规DNA提取方法分别提取三者的DNA；

C-2、PCR扩增：以C-1所得DNA样品为模板，利用步骤B所得工作液在PCR扩增仪中分别对待测物、对照物0及对照物1进行扩增；

C-3、扩增产物的检测：非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测步骤C-2所得的扩增产物，用银染法进行染色，并在凝胶成像仪上照相；

C-4、结果比对：将待测远缘杂交后代材料的电泳图谱分别与对照物0、对照物1的电泳图谱进行比对，如果待测远缘杂交后代材料和对照物1的电泳图谱均有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中含有待测黑麦染色体；如果待测远缘杂交后代材料的电泳图谱与对照物0的电泳图谱一致，均不含有特异扩增片段，说明远缘杂交后代材料中不含有待测黑麦染色体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤C-2中对所述待测物、对照物0及对照物1的DNA模板进行扩增的具体操作为，在体积为0.2ml的Eppendof管中依次加入30ng的模板DNA，1×PCR buffer，1.5mmol L^-1MgCl₂，200mmol L^-1dNTP，正、反向引物各0.2μmol L^-1，0.5U Taq DNA聚合酶，最后用无菌超纯水补充反应体系至10μl，然后将Eppendof管放在GeneAmp9700基因扩增仪上进行扩增反应。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述扩增反应的具体程序为，先94℃预变性5min；然后94℃变性1min，根据标记引物的退火温度退火1min，72℃延伸1min，循环38次；最后72℃延伸10min，10℃保存；标记引物的退火温度为60℃。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤C-3中所述扩增产物的检测方法具体为，在步骤C-2所得的扩增产物中加入上样缓冲液2μl，混匀之后取3μl，用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳电压为150～180V，电泳1～2h。