[发明专利]一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，尤其涉及一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法。

背景技术

截至目前国内外尚无人建立海洋双壳类细胞的体外培养体系，将范围扩展至软体动物门类，目前仅有一个细胞系成功建立，来自一种淡水蜗牛。

细胞的取材：体外培养的细胞多取材于动物胚胎、成年动物组织、人体手术活体材料，幼虫细胞是兼具胚胎细胞和幼虫期特有细胞性质的高分裂能力的细胞，是一类具有体外培养前景的细胞来源。

虾夷扇贝担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献：Primary cell culture fromembryos of the Japanese scallop Mizuchopecten yessoensis(Bivalvia)(1991Cytotechnology)

贻贝面盘幼虫细胞的体外培养。(备注：面盘幼虫是担轮幼虫下一个发育阶段。)参考文献：Isolation and partial characterization of myogeniccellsfrom mussel larvae in vitro(2000Tissue Cell.)

紫贻贝担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献：Comparative Characteristicof Mytilus Muscle Cells Developed In Vitro and In Vivo.(2003Journalof Experimental Zoology.)

油黑菜蛤担轮幼虫细胞的体外培养。参考文献：Muscle and neuronaldifferentiation in primary cell culture of larval Mytilus trossulus(Mollusca：Bivalvia)(2010Cell Tissue Research)

幼虫细胞的解离方式：上述幼虫细胞均采用无钙水浸泡后再经0.25％或0.125％胶原酶解离的方式获得单个的细胞。

幼虫细胞的除菌方法：虾夷扇贝，紫外线消毒海水并添加500U/ml青霉素和40μg/ml庆大霉素，培养基中添加40mg/l庆大霉素；油黑菜蛤，Percoll密度梯度离心法。

细胞传代方式：目前尚无关于幼虫细胞的传代方法的报道，传代培养的核心工作有两方面，一是分割培养物，二是再次接种。把贴壁依赖型细胞从培养基质上解离下来的方法主要有：1).胰蛋白酶溶液消化；2).对于贴壁不牢的细胞可采用机械的振荡法。

幼虫培养基的优化：虾夷扇贝幼虫细胞培养基：L15基础培养基；添加如下盐离子使渗透压达到1100毫渗透摩尔浓度：NaCl(18.05克/升)，KCI(0.29克/升)，CaCl₂·2H₂O(1.205克/升)，MgCl₂·6H₂O(5.481克/升)，MgSO₄·7H₂O(4.28克/升)。另添加如下成分：牛磺酸(25毫克/升)，葡萄糖(50毫克/升)，谷氨酰胺(100毫克/升)，胎牛血清(2％体积比)，庆大霉素(40毫克/升)。

担油黑菜蛤幼虫细胞培养基：L-15基础培养基；胎牛血清(2％体积比)，胰岛素(50毫克/升)，维生素E(1.75毫克/升)。

现有技术的缺点是无法实现贝类细胞的传代培养。

发明内容

本发明提供了一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，旨在解决现有技术无法实现贝类细胞的传代培养的问题。

本发明的目的在于提供一种栉孔扇贝担轮幼虫细胞系的培养方法，该培养方法包括以下步骤：

将单个栉孔扇贝担轮幼虫细胞均匀分布在含有0.5毫升栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养液的直径为35毫米细胞培养皿中，并放置到20-23℃的生化培养箱中培养，16-24小时后得贴壁的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞；

根据栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用培养基的颜色变化，每3-7天替换栉孔扇贝担轮幼虫细胞专用培养基2毫升，当栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞形成克隆时，挑取出来实现早期传代；

当传代后的栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞长满细胞培养瓶底面后，采用机械传代法完成栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞的传代培养。

进一步，栉孔扇贝担轮幼虫体外培养细胞专用高抗生素培养液中添加有2500-25000单位/毫升青霉素、2500-25000微克/毫升链霉素。