[发明专利]六聚组氨酸标签蛋白免疫亲和纯化富集柱制备及其应用

权利要求书

1.一种六聚组氨酸标签蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于：

1）将免疫亲和纯化的六聚组氨酸His特异性多克隆抗体采用流式过柱的化学偶联反应偶联到过碘酸钠氧化的琼脂糖Agarose上，用硼氢化钠还原，用蒸馏水清洗未结合的抗体，用磷酸缓冲液PBS清洗填料，10倍填料体积/次，洗4次，滴干PBS后加入等体积甘油，混匀，即得His标签重组蛋白免疫亲和填料；

2）将His标签重组蛋白免疫亲和填料装入塑料柱中，按需要的体积装柱，即得所述的His标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱。

2.根据权利要求1所述的六聚组氨酸标签蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于：所制的His标签重组蛋白免疫亲和纯化富集柱，包含偶联有免疫亲和纯化的His特异性多克隆抗体的琼脂糖填料及装载该免疫亲和填料的塑料柱。

3.根据权利要求1所述的六聚组氨酸标签蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于：所述的免疫亲和纯化的His特异性多克隆抗体，是用His短肽偶联活化的载体蛋白制得免疫原免疫动物，得到含抗体血清，将含抗体血清上到偶联有His短肽的免疫亲和层析柱，清洗未结合的杂质，用弱酸洗脱下His特异性多克隆抗体，脱盐、冻干备用。

4.根据权利要求3所述的六聚组氨酸标签蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于：所述的His短肽，采用His六聚组氨酸中的4组氨基酸残基，分成2组以相反方向引入半胱氨酸巯基SH基团制得巯基化的His短肽，其序列为:1）半胱氨酰-组氨酰-组氨酰-组氨酰-组氨酸即C-HHHH，2）组氨酰-组氨酰-组氨酰-组氨酰-半胱氨酸即HHHH-C。

5.根据权利要求3所述的六聚组氨酸标签蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于：所述的His短肽偶联活化的载体蛋白制得的免疫原，用十二烷基磺酸钠SDS变性血蓝蛋白KLH或卵清蛋白OVA等常用载体蛋白，再与碘乙酰-羟基琥珀酰亚胺酯即碘乙酰-NHS反应生成碘乙酰化 KLH或OVA 。

6.通过葡聚糖凝胶G25 Sephadex脱盐去掉过量的碘乙酸后，将巯基化His短肽与碘乙酰化的KLH或OVA混合，调pH=8.5，在室温摇动反应60分钟，经G25 Sephadex脱盐后得到的为免疫原。

7.根据权利要求3所述的六聚组氨酸标签蛋白免疫亲和纯化富集柱的制备方法，其特征在于：所述偶联有His短肽的免疫亲和层析柱，是将2种方向相反巯基化的His短肽半抗原与碘乙酰化的Agarose反应，形成化学共价键复合体填料His-Agarose，将His-Agarose装柱即得偶联有His短肽的免疫亲和层析柱。

8.一种六聚组氨酸标签蛋白免疫亲和纯化富集柱的应用，是将免疫亲和纯化富集柱与用辣根过氧化物酶标记HRP的免疫亲和纯化的His特异性多克隆抗体联用。