[发明专利]检测黄热病毒的试剂及检测黄热病毒的方法

权利要求书

1.一种等温扩增检测黄热病毒的试剂，其特征在于：它包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP；引物基因序列如下：

外引物F3:TGGGAGAGGAGATTCACGT；

外引物B3:TCAAGCCGCCAAATAGCC；

内引物FIP:

CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG；

内引物BIP:

AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG。

2.一种等温扩增检测黄热病毒的方法，其特征在于：

反应体系如下：20mmol/l Tris-HCl，10mmol/l KCl，10mmol/l(NH₄)₂SO₄，8mmol/l MgSO₄，0.1％Tween-20，权利要求1所述的外引物F3与外引物B3浓度均为5pmol/l，权利要求1所述的内引物BIP与内引物FIP浓度均为40pmol/l，0.8mol/l甜菜碱，dNTP 1.4mmol/l，10U AMV逆转录酶，8U Bst-DNA聚合酶，5μl RNA模板，补足DEPC-H₂O至25μl；

所述方法的步骤为：将阴性对照、阳性对照和待测样本分别按上述反应体系孵育63℃1小时进行反应，其中阴性对照采用双蒸水，阳性对照采用黄热病毒疫苗株；反应结束后，进行以下三种试验中的至少一种：

1）、取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，检测样本孔中如产生阶梯状条带则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒；

2）、反应结束后，反应管离心6000rpm，3分钟，观察结果，阳性对照管可见白色沉淀，阴性对照管没有产生沉淀，样本管中如产生白色沉淀则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒；

3）、在反应体系中加入1.25μl荧光染料SYBR Green I，紫外灯下观察荧光强度的变化，阳性对照产生强烈绿色荧光，阴性对照荧光强度没有变化，样本管中如产生强烈绿色荧光则含有黄热病毒，反之没有黄热病毒。