[发明专利]一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量检测方法，属于分析化学领域。

背景技术

油菜素甾醇(brassinosteroids,BRs)是一种多羟基化的甾醇类化合物，是继生长素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯之后发现的第六类植物激素。迄今为止，已经发现包括28-norbrassinolide,28-norcastasterone,油菜素内酯（brassinolide），24-表油菜素内酯（24-epibrassinolide），油菜素甾酮（castasterone），24-表油菜素甾酮（24-epicastasterone）,高油菜素内酯（homobrassinolide）等几十种BRs类化合物。BRs在植物体内含量极低，通常为0.01-1ng/g。油菜素甾醇调控着植物的一系列生理学和代谢过程，包括种子的发芽，幼苗的生长到成熟，种子的发育等。同时，BRs还对植物细胞的伸长、分裂和分化，作物产量的增加，生殖，衰老，对乙烯生物合成的感应，根的生长和发展，花粉管的形成，质子泵的激活，光合作用以及对抗氧化系统的感知等特异性生理学过程有重要作用。近年来，关于油菜素甾醇的生理学机能，例如BRs的生物合成，降解以及代谢路径的研究受到广泛关注。但由于植物的提取液中基质复杂且油菜素甾醇含量极低，这些研究的开展受到一定限制。因此，建立高效的样品前处理方法并结合高灵敏度的检测方法是BRs检测的关键。

目前，已报道的植物中油菜素甾醇的前处理方法包括液液萃取、固相萃取、磁固相萃取和液相色谱纯化方法等。这些方法均对样品量提出很高的要求，多数要求40g鲜重以上，显然如此大的样品量对于部分珍贵的样品是无法实现的，同时也给样品前处理过程带来溶剂消耗大和成本高等问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种简单、快速的植物样品的处理方法，并实现内源性油菜素甾醇的定量检测。

本发明为解决上述技术问题所提出的技术方案为：一种植物样品中内源性油菜素甾醇的定量检测方法，包括以下步骤：

1）提取内源性油菜素甾醇：准确称量植物样品后将其置于研钵中，液氮冷冻研磨至粉末状后，加入同位素内标[²H₃]油菜素内酯和[²H₃]油菜素甾酮，以乙腈提取后，-18℃以下放置12h以上；

2）除水：对步骤1）提取后的样品进行除水；

3）固相萃取除杂：将步骤2）除水后的样品溶液通过活化后的双层固相萃取小柱，解吸后收集上样流出液和解吸液，除去样品中的溶剂；

4）液液萃取除杂：将步骤3）所得的样品以乙醚溶解，涡旋静置后弃水相，加入pH为2~10的缓冲溶液，涡旋静置后弃水相，重复除杂3次或3次以上，取乙醚相，吹干，定容；

5）定容检测：将步骤4）定容后的样品进入高效液相色谱-电喷雾-串联质谱分析，测量出油菜素甾醇。

上述双层固相萃取小柱的填料为石墨化碳黑/乙二胺-N-丙基键合硅胶。

除水是将步骤1）提取后的样品离心，取上清液，向上清液中加入氯化钠，用涡旋混合仪剧烈震荡使水相与有机相分层，弃水相，再向有机相中加入无水硫酸镁除水。

缓冲溶液是用磷酸氢二钠、甲酸铵等缓冲盐配制的水溶液。

本发明的植物样品包括：水稻、油菜、拟南芥、番茄、烟叶等植物的根、茎、叶、花、花粉等组织及其组织提取液。

在固相萃取步骤中，乙二胺-N-丙基键合硅胶是最常用的吸附剂，其在去除极性杂质（例如有机酸、极性色素、糖类）等方面表现出优良的性能。此外，植物基质中的疏水基质对后续的液相分离和质谱灵敏度也有一定影响。石墨化碳黑具有很强的疏水性，能和π体系的化合物产生π-π作用。植物提取液中的叶绿素为平面的π体系化合物，有望与石墨化碳黑通过π-π作用结合而被去除。因此，石墨化碳黑和乙二胺-N-丙基键合硅胶结合可有效去除植物提取液中的极性和非极性杂质。

本发明以双层固相萃取柱（石墨化碳黑/乙二胺-N-丙基键合硅胶）可以有效地去除植物基质，需要的样品量小，同时实现快速、有效的油菜素甾醇检测方法，仅在1g植物叶片和0.5g花中实现了内源性油菜素甾醇的检测。

附图说明