[发明专利]一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达及应用

权利要求书

1.一种猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达，其特征在于其包括以下步骤：

1）TTSuV2 ORF1待表达片段的选择: 以TTSuV2阳性样品的核酸为模板，在病毒基因序列的保守区设计引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2，应用LA TaqDNA 聚合酶扩增目的片段；对扩增产物进行电泳，切下目的条带，利用OMEGA 胶回收试剂盒回收DNA，对纯化的片段进行测序，使用Clustal X软件包对测序结果进行序列匹配和多重序列比对，获取TTSuV2 ORF1序列SEQ ID NO:3；

2）TTSuV2 ORF1’片段的选择：应用ProtScale氨基酸分析软件在上述的TTSuV2 ORF1序列SEQ ID NO:3中选出预测抗原性较强且抗原区较为集中的TTSuV2 ORF1’序列为SEQ ID NO:4的蛋白片段；

3）TTSuV2 ORF1’的酵母表达：构建插入TTSuV2 ORF1’的pPICZαA重组质粒，电转化P．pastoris X-33酵母菌，筛选重组TTSuV2 ORF1’的高拷贝子，获取真核表达的TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段；

4）TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段的鉴定与纯化：筛选出的高拷贝子，用50%硫酸铵沉淀上清中蛋白，用8M的尿素溶解沉淀的蛋白，应用亲和层析的方法纯化重组TTSuV2 ORF1’，在PBS中透析后，应用BCA法进行定量，纯化后获得酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白。

2.根据权利要求1所述的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达，其特征在于：步骤1）应用LA TaqDNA聚合酶扩增目的片段的反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸120s, 共30个循环；72℃延伸8 min；反应完成后用1.0%的琼脂糖凝胶对扩增产物进行电泳。

3.根据权利要求1所述的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达，其特征在于：步骤3）的具体过程为：应用Primer Premier5.0设计引物SEQ ID NO:5和引物SEQ ID NO:6，以TTSuV2阳性核酸为模板，应用Kod plus高保真酶的PCR扩增反应获得目的条带，电泳、纯化目的条带；双酶切PCR产物及载体pPICZαA，连接，转化E. coli：DH5α后测序验证载体正确性，提取构建正确的重组质粒pPICZα‐TTSuV2 ORF1’，Sac I单酶切线性化；将酵母菌X‐33制备成感受态细胞，取出80μl感受态细胞与5～10μg线性化的重组表达质粒混合，转入0.2 cm电转杯，电转化，将菌液用1 ml冰浴山梨醇l0倍稀释后，涂布于基本葡萄糖培养基选择平板上，置于30℃培养2～3d，在200-1000μg/ml浓度段的Zeocin的YPD平板上筛选具有1000μg/ml Zeocin抗性且生长良好的菌株作为表达株，接种单菌落于25 ml BMGY培养基，于30℃培养至OD_600nm?4.0，离心、收集菌体，用100 ml BMMY培养基重悬培养，每日取样1ml，并补加纯甲醇于培养基至终浓度为0.5％，诱导表达5d，取样品离心收集上清作SDS -PAGE分析，以Anti -HIS -antibody为第一抗体，Western Blotting获得真核表达的TTSuV2 ORF1’目的蛋白片段。

4.根据权利要求3所述的猪Ⅱ型细环病毒TTSuV2-ORF1截短蛋白的酵母表达，其特征在于：所述Kod plus高保真酶的PCR扩增反应程序为94℃预变性 5min；94℃变性30s，52℃退火30s，68℃延伸40s, 设置30个循环；68℃延伸8min。

5.权利要求1所述的酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白作为包被抗原在TTSuV2抗体间接ELISA诊断试剂盒中的应用。

6.一种TTSuV2 抗体间接ELISA 诊断试剂盒，其特征在于：其包括用权利要求1所述的酵母表达的TTSuV2-ORF1截短蛋白包被抗原包被的酶标板，100μl TTSuV2阳性对照血清，100μl TTSuV2阴性对照血清，100μl HRP标记兔抗猪二抗，100μl抗体稀释液、100μl显色液、100μl终止液以及洗脱液。