[发明专利]磁性纳米载体介导的植物转基因方法

说明书

技术领域

本发明涉及纳米生物技术和生物纳米材料应用等领域，具体指一种以磁性纳米载体介导的植物转基因方法。

背景技术

植物基因工程是应用重组DNA技术，将外源基因导入到受体植物细胞内，使受体植物获得新的遗传性状。20世纪80年代，在细胞和组织培养、分子生物学研究领域取得一系列重大进展的基础上，植物基因工程到得到了迅猛的发展。棉花是我国重要的经济作物，对农业和棉纺行业的发展具有举足轻重的作用，但传统的育种方法多限于品种间或种间的染色体重组，具有很大的局限性。因此利用基因工程技术培育棉花新品种具有十分重要的意义。我国棉花生物技术研究起始于20世纪70年代，近年来随着植物转基因研究的蓬勃发展，转基因技术的不断改进和完善，转基因技术已经应用于棉花抗虫、抗除草剂、抗病、提高产量和品质改良育种的实践中，并得到了抗虫、抗除草剂、抗病等转基因新品种(系)，有些已经进入商品化生产，取得了显著的经济效益和社会效益，特别是中国农业科学院郭三堆等科学家培育成功的转基因抗虫棉的大面积推广，极大地促进了我国棉花产业的发展，不仅使棉花产量得到了显著提高，也大量减少了杀虫剂的使用，充分体现了转基因作物在农业生产中重要的经济与社会价值。因此，充分运用转基因技术，在高产、优质的棉花品种上，进一步导入抗病虫、抗除草剂、耐盐碱、耐干旱等基因，获得抗逆性优良的转基因棉花种质新材料，对转基因棉花新品种具有重要的现实意义。应用于棉花的转基因技术主要有农杆菌介导的外源基因导入方法、外源基因直接导入的花粉管通道法和基因枪法，这三种方法也是应用最广泛的植物遗传转化手段。

自从1987年Umbeck和Firoozababy等通过根癌农杆菌介导转化获得第一个表达外源基因的转基因植物以来，该方法在棉花遗传转化中得到了迅速应用。当前通过各种转基因技术已获得的近200种转基因植物，其中80%以上是利用根癌农杆菌转化方法获得的。该方法以转基因低拷贝、遗传稳定性好、能够转化大片段的DNA、转化效率高等优点倍受人们的关注，是目前转化机理研究最清楚，应用最广泛的方法。棉花的遗传转化采用的根癌农杆菌为土壤喜居菌，革兰氏染色呈阴性（李俊兰，2002）。利用农杆菌转移外源基因的过程一般是（1）将目的基因导入中间载体或二元载体；（2）将带有目的基因的中间载体或二元载体导入农杆菌；（3）使农杆菌感染寄主（受体）植物细胞或组织；（4）筛选转化细胞并诱导其再生植株；（5）对转基因植株进行分子检测。农杆菌介导的基因转移所适用的外植体非常广泛，包括叶片、茎段、胚轴、叶柄、子叶、幼胚或成熟种子。在棉花上常用的为下胚轴。

但是，影响农杆菌介导法的因素较多，主要有外植体类型和生理状态、外植体是否进行预培养、Vir基因活化状况、pH值、温度、渗透压、肌醇浓度以及一些糖类。棉花农杆菌介导遗传转化方法，由于其转化受体材料严格受基因型的限制、通过再生途径获得的转基因苗周期长、获得转基因苗由于其脱分化和再分化导致体细胞变异而突变率高等因素，制约了农杆菌介导的遗传转化方法在棉花基因工程中的应用。

花粉管通道途径（pollen tube pathway）是周光宇等人（1978）提出DNA片段杂交理论之后设计的自花授粉后外源DNA导入植物的转基因技术。棉花胚珠在授粉之前，珠心是一个封闭的体系，授粉后随花粉管的伸入，从珠孔到胚囊的一些珠心细胞退化形成一条通道，以利于花粉管进入胚囊，外源DNA可以通过花粉管通道进入胚囊，转化尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞从而参与到新形成的种子中。由于这些细胞不具备正常的细胞壁，可作为天然的原生质体，易于DNA转化，受精后细胞DNA复制活跃，易于外源DNA的整合。用同位素示踪技术已经证实外源DNA是通过花粉管通道而不是通过花粉管进入胚囊的（龚蓁蓁，1988；黄国存，1998）。黄骏麒等(1981)应用花粉管通道法成功地将抗病基因导入高产、优质、感病的棉花品种中，获得耐黄萎病、抗枯萎病的棉花3118新品种。倪万朝等（1998）通过花粉管通道法将Bt基因导入泗棉3号，选育出了我国第一批通过审定的转基因抗虫棉GK1。