[发明专利]一种提取毕赤酵母各生长时期总RNA的改良方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学研究领域，为一种提取毕赤酵母各生长时期总RNA的改良方法。

背景技术

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是近年来发展起来的较为完善的，被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统，外源蛋白在毕赤酵母中的过量表达，经常伴随着其他基因表达水平的改变，通过分析相关基因表达水平的差异，便于找到影响外源蛋白表达量的关键问题，而基因表达水平的分析常常涉及到总RNA的提取。

与其他细胞相比，毕赤酵母由于具有较坚固的细胞壁，尤其是处于稳定期的毕赤酵母细胞，其细胞壁更厚、通透性差，这些因素都增加了总RNA的提取难度，而总RNA提取质量直接会影响后续基因表达水平测定的准确性。

发明内容

本发明的目的是提供一种提取毕赤酵母各生长时期总RNA的改良方法，用以解决分子研究中遇到的毕赤酵母细胞总RNA提取(尤其是稳定期总RNA的提取)困难的问题。

毕赤酵母总RNA的提取，关键问题是细胞壁的去除，酵母生长的不同时期，其细胞壁的厚度会发生变化，一般稳定期较对数期的细胞壁要厚，这样就使稳定期总RNA的提取更加困难，但与基因组的提取不同，酵母总RNA提取之前的去壁处理不能用酶解法，因为此法需在37℃进行，该温度会使酵母中某些基因的转录情况发生改变。

针对以上问题，本发明研究出了一种较为快速且适用于毕赤酵母各生长时期总RNA提取的改良方法，此法在总RNA提取的纯度与质量上都满足QRT-PCR的要求。本发明是在上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒的基础上进行改良，即在抽提前，对毕赤酵母细胞的破碎进行改良：通过毕赤酵母细胞和酸洗玻璃珠在液氮条件下共研磨，使毕赤酵母细胞充分破碎，此破碎方法适合各生长时期的毕赤酵母细胞。然后再利用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒中的的Trizol试剂，进行抽提及后续操作，经过改良，提取的毕赤酵母总RNA，有清晰整齐的28SrRNA和18SrRNA条带，并且成2倍关系，表明此法提取的总RNA完整，再通过核酸浓度测定仪测定，OD₂₆₀/OD₂₈₀＝1.9～2.0，表明纯度也满足要求，综上说明此法提取的总RNA质量满足QRT-PCR要求。

本发明具体包括以下材料：

(1)毕赤酵母细胞破碎所需材料：瓷研钵、液氮、酸洗玻璃珠(400nm)、Trizol试剂。

(2)上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒组成为：Trizol Reagent、RPE Solution、DEPC-treated ddH₂O、吸附柱和收集管。

(3)其余试剂及耗材：无水乙醇、氯仿、1.5mL EP管、用0.1％DEPC预处理的枪头和EP管。本发明具体实验步骤为：

(1)取约1×10⁷个待测毕赤酵母细胞(任何生长时期的细胞)于灭菌的1.5mL EP管中，利用液氮法快速冷冻后冻存于-70℃冰箱。

(2)先将瓷研钵用液氮预冷，然后倒入0.3g酸洗玻璃珠。

(3)向冻存的毕赤酵母细胞中加入50μL DEPC-treated ddH₂O，重悬菌体后转入加有酸洗玻璃珠的预冷瓷研钵中。

(4)倒入适量液氮，使细胞和酸洗玻璃珠共研磨，直至酸洗玻璃珠磨至粉末(约5min)，此研磨过程液氮挥发尽后，需及时补加液氮，整个过程要一直保持低温状态。

(5)研磨完毕后，向其中加入0.5mL Trizol试剂，室温放置5min。

(6)将研钵中所有物质转入1.5mLEP管中，用枪头吹打2min后，室温静置5-10min。

(7)后续实验步骤按上海生工UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒操作进行。

本发明的主要优点：(1)与hot acid phenol方法相比，此法适用于毕赤酵母各生长时期总RNA的提取，即使对于细胞壁很厚的稳定期细胞，此法仍然可以成功地提取出总RNA，提取结果稳定。(2)此法提取的总RNA质量好，有清晰整齐的28SrRNA和18SrRNA条带，并且成2倍关系，且满足OD₂₆₀/OD₂₈₀在1.8-2.1之间的纯度要求，较少出现降解情况。

附图说明

图1：X-33和GS115毕赤酵母在72h和96h总RNA的提取结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。