[发明专利]一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法

权利要求书

1.一种肺炎链球菌荚膜多糖的制备方法，该方法包括以下步骤，肺炎链球菌的培养，灭活，肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取，肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制，其特征在于，

所述肺炎链球菌的培养，方法如下：

搅拌式发酵罐接种后，pH控制在6.5-8.0，转速50-200r/min，培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在1-10％，当发酵液菌浓达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在0.01-2％，当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体；

所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取，方法如下：

a、取灭活后的肺炎链球菌培养液，去除菌体、菌体碎片及培养液中的小分子成分，得浓缩液；

b、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为15-35％后，2-8℃静置过夜；

c、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为60-90％后，2-8℃静置过夜；

d、所得静置液离心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液复溶后，离心去除沉淀，所得上清即为粗糖溶液；

所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的精制，方法如下：

所得粗糖溶液，采用分子筛排阻层析分离，按照各个型别的肺炎多糖在欧洲药典5.0版中的标准收集大分子多糖；分离后的多糖采用30kDa超滤膜包脱盐，再经冷冻干燥后即得肺炎链球菌荚膜多糖。

2.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取，步骤如下：

a、取灭活后的肺炎链球菌培养液，去除菌体、菌体碎片、培养液中颗粒性物质及小分子成分，得浓缩液；

b、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为20-30％后，2-8℃静置过夜；

c、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为75-85％后，2-8℃静置过夜；

d、所得静置液离心收集沉淀，沉淀用水或NaCl溶液复溶后，离心去除沉淀，所得上清即为粗糖溶液。

3.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，所述肺炎链球菌荚膜粗多糖的提取，步骤如下：

a、取灭活的菌体后肺炎链球菌培养液，采用15000g离心30min去除菌体及菌体碎片，上清液进一步采用微滤或深层过滤的方式去除残余的颗粒性物质；澄清后的溶液采用100kDa的超滤系统浓缩并去除培养液中的小分子成分，最终得浓缩液；

b、浓缩液缓慢加入乙醇至终浓度为25％后，2-8℃静置过夜；

c、所得静置液离心去除沉淀，上清继续加乙醇至终浓度为80％后，2-8℃静置过夜；

d、所得静置液15000g离心30min收集沉淀，沉淀采用0.2M NaCl溶液复溶，复溶液15000g，离心30min去除沉淀得上清，即为粗多糖溶液。

4.如权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，分子筛排阻层析所用填料选自：Sepharose CL-2B、Sepharose CL-4B、Sephacryl S-200、Sepharose 4Fast Flow或Superdex 200；按照各个型别的肺炎多糖在欧洲药典5.0版中的标准收集大分子多糖；分离后的多糖采用30kDa超滤膜包脱盐，再经冷冻干燥后即得肺炎链球菌荚膜多糖。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肺炎链球菌的培养，步骤如下：搅拌式发酵罐接种后，pH控制在7-7.5，转速70-150r/min，培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在3-7％，当发酵液菌浓达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在0.1-1.0％，当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肺炎链球菌的培养，步骤如下：搅拌式发酵罐接种后，培养温度37℃±2℃，pH维持在7.2±0.2，转速100r/min，转速培养开始阶段采用从发酵罐底部通压缩气体，溶氧量控制在5％，当发酵液菌浓达到0.5-1时，改变通气方式为从发酵罐的顶部通压缩气体，溶氧控制在0.2％，当发酵液菌浓达到2-2.5时，适量补充碳源，继续培养至菌体生长的平台期后灭活菌体。