[发明专利]一种糖化酶有效

专利信息
申请号: 201210491553.2 申请日: 2012-11-27
公开(公告)号: CN102994476A 公开(公告)日: 2013-03-27
发明(设计)人: 黄亦钧;刘士成;王华明;张慧丹 申请(专利权)人: 青岛蔚蓝生物集团有限公司
主分类号: C12N9/34 分类号: C12N9/34;C12N15/56;C12N15/63;C12N1/15;C12R1/885
代理公司: 青岛海昊知识产权事务所有限公司 37201 代理人: 曾庆国
地址: 266061 山东省青岛市*** 国省代码: 山东;37
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摘要:
搜索关键词: 一种 糖化酶
【说明书】:

技术领域

发明属于微生物工程技术领域,具体涉及一种糖化酶及用于表达该糖化酶的重组表达工程菌。

背景技术

糖化酶,又称葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase),它能把淀粉从非还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖,也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键,转化为葡萄糖。同时也能水解糊精,糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵;本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之,凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上,都可适用。

我国高转化率糖化酶市场发展迅速,产品产出持续扩张,国家产业政策鼓励高转化率糖化酶产业向高技术产品方向发展。2011年国内糖化酶的市场容量为5亿元人民币,而且市场以每年20%速度在增长。预计2012年市场容量不低于6亿元。糖化酶价格则自2007年起不断上涨,由2元/公斤涨到2.7元/公斤。因此,国内企业新增糖化酶投资项目也逐渐增多。

目前常用的糖化酶均是来自黑曲霉。自70年代中期开始,中科院微生物所筛选获得了高产糖化酶菌株AS.3.4309。该菌株国内许多大型抗生素制药厂、酒精厂、酿酒厂进行了生产规模试验,均获得成功。该项目的成功为我国发酵行业节约了大量的粮食,产生了巨大的经济效益和社会效益。市场越来越密切关注高转化率糖化酶,这使得克隆和表达高转化率糖化酶成为研究的热点之一。蛋白表达系统是黑曲霉,其产酶量(蛋白量)较高,但是受到糖化酶本身性质的影响,黑曲霉表达糖化酶的比活比较低,不能适应市场的需求。因此,开发性能优良、比活高的糖化酶越来越受到各方的关注。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型糖化酶及其重组表达工程菌,并将筛选的糖化酶基因转入里氏木霉(Trichoderma reesei)中进行表达,为实现糖化酶的高密度发酵生产奠定了基础。

本发明一方面提供一种新型的糖化酶,所述的糖化酶包括

1)氨基酸序列为SEQ ID NO:1的糖化酶;

2)在1)限定的氨基酸经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有糖化酶功能的,由1)衍生的蛋白质。

用于编码上述糖化酶的基因,其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明另一方面提供了一种表达载体,其包含上述编码糖化酶的核苷酸。

本发明另一方面提供了一种表达宿主细胞,其携带有表达上述糖化酶基因的表达载体。

上述表达宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei)。

本发明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表达,酶活水平达到148U/mL。所述糖化酶能从糖链的非还原端高效分解α-1,4-糖苷键,因此,有望将其应用于全酶法生产葡萄糖的糖化过程。

附图说明

图1 :本发明构建的表达载体质粒图谱。

图2 :里氏木霉工程菌发酵上清液的SDS-PAGE电泳分析图,其中箭头所指为重组表达的糖化酶。

具体实施方式

以下实施例是为了更好地说明阐述本发明内容,本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是,本发明的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。

实施例1绳状青霉(Penicillium funiculosum)糖化酶基因的克隆

1.1总DNA的提取

将绳状青霉(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心,菌株编号 3.3791)过夜培养,取适量菌体置于离心管中,13000 rpm离心5 min,弃上清;加入400μl抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS); 然后加100mg石英砂或玻璃珠,在珠打仪剧烈振荡2min左右;65℃水浴20min后,加入200μl 10M NH4AC,冰浴10min;13000rpm离心10min,取上清;加入2倍体积的无水乙醇,-20℃放置30min;13000 rpm离心10min,弃上清;用70%乙醇洗涤2次;晾干,加入水溶解,于-20℃保存。

1.2基因克隆

以1.1中提取的基因组总DNA为模板进行PCR扩增,引物序列如下:

上游引物:ATGGCTGTAACAGCTGCCTTGGCCG

下游引物:CTACTGCCAGCTATCGTTGATGCAGPCR。

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