[发明专利]醉魂藤外植体灭菌接种方法

说明书

技术领域

本发明属于植物外植体灭菌接种领域，特别是醉魂藤外植体灭菌接种技术领域。

背景技术

醉魂藤，拉丁名Heterostemma alatum Wight，为萝藦科醉魂藤属的植物。分布于印度、尼泊尔以及中国大陆的云南、贵州、广西、广东、四川等地，生长于海拔1,200米的地区，常生于山谷水旁林中荫湿处，目前尚未由人工引种栽培。醉魂藤可入药，其根可治疗风湿。现已运用多种色谱技术从云南产醉魂藤Heterostemma alatum wight中分离得到10个化合物。通过理化鉴别和波谱数据确定了他们的化合物结构分别为β-谷甾醇(1)、正二十四烷酸(2)、芹菜素(3)、胡萝卜苷(4)、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷(5)、醉魂藤碱A(6)、醉魂藤碱B(7)、醉魂藤碱C(8)、醉魂藤碱D(9)和醉魂藤碱F(10)。因此利用组培技术大量繁殖该植物育有重要的生物和医学意义。

醉魂藤外植体灭菌以往先用自来水清洗，再用70%酒精漂洗，然后用3%安替福民溶液浸泡30分钟，用无菌水冲洗3次，用无菌纸吸干后进行接种。由于醉魂藤外植体茎干较细弱，传统灭菌方法使外植体死亡率和污染率较高，因此找到合适的消毒药剂和合适的消毒时间是完善醉魂藤组培快繁的必要举措。

发明内容

本发明的目的是提供一种更加适合醉魂藤外植体灭菌的方法。

实现上述目的采用下述技术方案：一种醉魂藤外植体灭菌接种方法，包括如下步骤：

（1）剪取醉魂藤休眠枝或当年生新梢茎段；

（2）用消毒剂消毒；

（3）再用灭菌剂灭菌；

（4）灭菌后立即用无菌水清洗3次；

（5）在无菌培养皿中切取外植体茎段接种于培养基进行组织培养。

进一步，所述的消毒剂为70%酒精，消毒时间为5-10s。

进一步，所述的灭菌剂为0.1%升汞，灭菌时间为10-20min。

进一步，所述的培养基是1/2MS培养基，培养条件是光照强度2000Lx，温度26℃，光照时间14h/d。

1/2MS培养基是购自上海士锋生物科技有限公司的，与MS培养基相比，大量元素减半，微量元素和维生素的成分不变。

本发明的有益效果是：使用上述外植体灭菌方法，提高了存活率和萌芽率达，同时降低了污染率。

具体实施方式

实施例1

休眠枝对照组消毒药剂及其用法：70%酒精，3%安替福民。酒精浸泡35s后，在安替福民溶液中的休眠枝浸泡时间为30min。经过安替福民消毒过的休眠枝，在休眠枝消毒后均立即用无菌水清洗3次，在无菌培养皿中切取外植体茎段接种于1/2MS培养基上。

休眠枝实验组消毒药剂及其用法：酒精中浸泡35s，在升汞溶液中的休眠枝浸泡时间分为15min，在休眠枝消毒后均立即用无菌水清洗3次，在无菌培养皿中切取外植体茎段接种于1/2MS培养基上。

实验材料及方法：

将醉魂藤茎段接种后，均放在培养室培养，培养条件为：光照强度2000Lx，温度26℃，光照时间14h/d。培养2周后观察接种茎段的污染率和萌芽率等指标，其中污染率=受污染茎段数/接种茎段数×100%，萌芽率=萌芽的未受污染茎段数/未受污染茎段×100%。

在该组4000株茎段中，2000株使用安替福民溶液灭菌30min的污染率为69%，而剩余2000株使用升汞溶液灭菌15min的污染率为30%，活率达70%，萌芽率达65%。

实施例2：

当年生新梢对照组消毒药剂及其用法：70%酒精，3%安替福民。酒精浸泡10s后，在安替福民溶液中的当年生新梢浸泡时间为20min。经过安替福民消毒过的当年生新梢，在当年生新梢消毒后均立即用无菌水清洗3次，在无菌培养皿中切取外植体茎段接种于1/2MS培养基上。

当年生新梢实验组消毒药剂及其用法：酒精中浸泡10s，在升汞溶液中的当年生新梢浸泡时间为10min，在当年生新梢消毒后均立即用无菌水清洗3次，在无菌培养皿中切取外植体茎段接种于1/2MS培养基上。

实验材料及方法：

将醉魂藤当年生新梢茎段接种后，均放在培养室培养，培养条件为：光照强度2000Lx，温度26℃，光照时间14h/d。培养2周后观察接种茎段的污染率和萌芽率等指标，其中污染率=受污染茎段数/接种茎段数×100%，萌芽率=萌芽的未受污染茎段数/未受污染茎段×100%。