[发明专利]一种肺炎链球菌荚膜多糖蛋白结合疫苗的制备方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种疫苗的制备，特别涉及一种肺炎多糖蛋白结合疫苗及其制备方法。

背景技术：

肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）可引起鼻窦炎、中耳炎、气管炎和肺炎等非侵袭性感染以及脓毒症和脑膜炎等侵袭性感染，是一种引起所有年龄组高发病率和病死率的主要致病菌。在儿童呼吸系统中，肺炎发病率居第二位。世界卫生组织（WHO）调查数据显示，每年死于肺炎链球菌感染的160万人中，约有60%人群为5岁以下儿童。可见，肺炎链球菌堪称威胁儿童健康的“头号杀手”。目前，中国是全世界发病率高的五个亚洲国家之一。

在中国的调查数据显示，由于抗生素的过度使用，目前肺炎球菌对于红霉素和青霉素等常见抗菌素的耐药性正在升高，《应高度重视儿童肺炎的预防措施）一文中提到例如血清6型对红霉素的耐药性已经达到百分之百。因此，接种肺炎球菌结合疫苗，是预防儿童患上肺炎球菌疾病的最佳方式。

目前，国内上市的肺炎球菌结合疫苗产品主要有辉瑞的7价肺炎球菌结合疫苗（PCV7），商品名为Prevenar，包含7种血清型的肺炎链球菌，分别为4,6B，9V，14,18C，19F和23F。PCV7的使用，降低了儿童侵袭性肺炎链球菌疾病（IPD）的整体发病率。但是由于该疫苗价格昂贵，接种四针需要花费3000多人民币，这或许会使许多家长望而却步，放弃对孩子的接种。另一方面流行病学调查显示，PCV7在美国和欧洲的覆盖率为86%和74%，而在亚洲的覆盖率仅为43% ，参见World Health Orgnization. Pneumococcal conjugated vaccine for childhood immunization-WHO position paper. WklyEpidemiol Rec, 2007, 82(12): 93-104 。而且广泛使用PCV7后的检测研究发现，非疫苗覆盖血清型引起的IPD发病率持续升高，例如19A，在美国，2000-2005年由19A引起的侵袭性肺炎链球菌疾病的增长超过330%。这种血清型替代可能消弱PCV7带来的益处。因此，开发价格适中并且适用中国国情的肺炎球菌结合疫苗迫在眉睫。 

由于肺炎链球菌荚膜多糖分子量大多大于1000KDa，且粘度较大，在与蛋白结合过程中容易交联形成分子量更大的结合物凝胶，不利于分离纯化，亦不利于控制多糖蛋白结合物中的蛋白与多糖的质量比。因此，需要将纯化的荚膜多糖进行水解处理。世界专利WO 2008/079732 A2，提到可以用醋酸对18C型和3型荚膜多糖进行降解，其他专利如WO 2007/071707 A2提到可以用微流体化法对多糖进行降解。但上述方法对于某些特殊的肺炎链球菌荚膜多糖的分离效果不佳，如在用醋酸对9V型和4型多糖进行酸水解过程中，导致9V型和4型多糖的抗原性丢失，表现为免疫双扩结果为阴性。

荚膜多糖的理化性质和生物活性与分子量及分子量分布有很大的关系。因此，在质量控制中，分子量是一个重要的指标。对于多糖类化合物，其分子量的描述和测定都较小分子困难得多。目前，传统的测定多糖分子量的方法是通过分子量标准品校正曲线来确定分子量大小以及分子量的分布。这些方法存在的问题在于，当所测样品的结构和性质与分子量标准品不同时，会给测定结果带来明显的误差。参见Wang W, Bo S, Li S,et al .Determination of the Mark-Houwink equation for chitosan with different degrees of deacctylation. Int J Biol Macromol,1991,13:281。本发明采用高效凝胶体积排阻色谱（SEC）与多角度激光散射（MALLS）检测器、示差折光（RI）检测器联用增加了测定结果的准确性。该方法可以直接反应各型多糖的绝对分子量大小，不会受到实验条件的影响。操作更加简捷，提高了工作效率。

本发明的目的之一在于提供一种多价或者13价肺炎多糖结合疫苗。其中13价疫苗含有13种血清型，分别为1,3,4,5,6A，6B，7F，9V，14,18C，19A，19F，23F。较目前上市的7价肺炎结合疫苗提供更广泛的保护，而且成本经济。本发明的目的之二在于公开一种荚膜多糖的水解方法——超声降解，这种方法简便易操作，且容易线性放大，多糖回收率达到90%以上。本发明的目的之三在于应用一种荚膜多糖分子量的测定方法—多角度激光散射法，该方法简便快速，可以准确获得分子量大小以及多糖的分散度等信息；本发明的目的之四在于提供一种多糖蛋白结合物的制备方法，CDAP活化多糖，该方法简便，结合效率高。