[发明专利]一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒及其应用方法

权利要求书

1.一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于该试剂盒包括：a)RNA裂解液、b)荧光定量反应液、c)鸭黄病毒强阳性质控品、d)阴性质控品，荧光定量反应液含有上游引物DFV-F和下游引物DFV-R 以及荧光探针DFV-P，上游引物 DFV-F序列为:  atgaataaggtggtgaaggtaatgc 25nt；下游引物DFV-R序列为： cagattcgtgaaagtgttgagagc 24nt；荧光探针DFV-P序列为：  catgactgttttcccatcacgtcccgg 27nt，荧光探针DFV-P 5＇端标记的是荧光报告基团FAM，3＇端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。

2.按权利要求1所述的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于荧光定量反应液由1×PCR Buffer, MgCl₂ 4mM, dNTPs 0.5mM, M-MLV酶50U ,Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R为各0.2μM,所述的荧光探针DFV-P 为0.2μM。

3.按权利要求1所述的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于所述的鸭黄病毒强阳性质控品为高滴度的鸭黄病毒监利株，其在鸭胚上增殖，经灭活后得到，经测量ELD₅₀为10^3.7/mL。

4.按权利要求1所述的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒，其特征在于所述的阴性质控品是采集健康的且无病原的鸭组织，按体积比1:5加入PBS液，充分匀浆破碎，离心去除沉淀，上清保存备用。

5.权利要求1所述的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒的应用方法，其特征在于包括以下步骤：

1）鸭黄病毒基因组RNA的提取：分别向200μl待检测标本、鸭黄病毒强阳性质控品和阴性质控品中加入1mlRNA裂解液，静置5min后，加入200μl氯仿，高速离心后吸取上清，上清中加入等体积的异丙醇，再进行冰浴并高速离心沉淀，所得沉淀用75%乙醇洗涤后，用20μl灭菌水溶解，所得溶液即为RNA模板；

2）分别取步骤1）得到的RNA模板加入到荧光定量反应液中，用荧光定量检测仪进行PCR反应并实时检测反应过程中释放的荧光强度，PCR反应得到鸭黄病毒特异性扩增目的基因，所述的鸭黄病毒特异性扩增目的基因序列为：atg aataaggtgg tgaaggtaat gcgaccggga cgtgatggga aaacagtcat ggatgtcatc tcgcgggaag accagagggg aagtggacag gttgtgactt atgctctcaa cactttcacg aatctgt。

6.按权利要求5所述的一种特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量RT-PCR快速诊断试剂盒的应用方法，其特征在于荧光定量反应液由1×PCR Buffer, MgCl₂ 4mM, dNTPs 0.5mM, M-MLV酶50U ,Taq酶2U，所述的上游引物DFV-F和下游引物DFV-R为各0.2μM,所述的荧光探针DFV-P 为0.2μM。

7.按权利要求5或6所述的特异检测鸭黄病毒感染的荧光定量PCR快速诊断试剂盒的应用方法，其特征在于,用于荧光定量RT-PCR检测仪进行PCR反应的反应条件为:

42℃ 反转录20min

94℃ 预变性5min

94℃变性10s ←→60℃退火、延伸 50s, 50 个循环。