[发明专利]增强外源蛋白表达的增强子样基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种增强外源蛋白表达的增强子样基因序列，用于提高外源基因在原核细胞中的蛋白表达水平。

背景技术

随着分子生物学及基因工程的发展，外源基因表达为蛋白表达系统的开发提供了广阔的应用前景。目前常用的蛋白表达系统有大肠杆菌表达系统、酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统等。大肠杆菌表达系统是目前研究较为成熟的，但是某些表达的目的产物仍表达水平很低；酵母表达系统也经常出现外源基因拷贝数低；哺乳动物细胞表达系统，外源基因不能持久表达，且成本很高，技术背景复杂。因此，无论在何种表达系统中，外源基因表达水平低都是一个共有的难题。20世纪80年代初，首先在真核病毒SV40基因组中发现了能够增强蛋白表达基因序列(Banerji J et aL,CeLL, 1981, 27(2Pt1): 299-308)，此后研究证明这类序列广泛存在于真核生物及其病毒基因组中，这对改造蛋白表达系统提供了一个新的方向。对原核生物基因表达调控的深入研究，人们发现在原核生物基因组也存在类似于真核转录增强调控模式，且某些真核生物DNA片段在原核细胞中也具有增强子样功能，这类序列称为增强子样序列（enhancer-Like sequence，ERLS）。目前开发改进的蛋白表达系统中，通过增加蛋白表达标签，补充外源基因表达所需的稀有密码子以及增加表达系统中外源基因拷贝数等方法使用较多，采用增强子样基因序列改进蛋白表达系统目前使用比较少，且很多未知的调控基因表达序列可能尚未被开发。

增强子（enhancer，ER），在基因表达调控中，增强子长度通常为100~200bp，与启动子、绝缘子及沉默子协同作用，对调控基因的时空表达具有重要作用。增强子重要作用特点之一：无方向性，即不论增位于启动子上游或下游，均能激活其相应启动子。它的增强活性能体现在基因的表达水平上，目前已有少数的增强子样序列应用于提高蛋白表达水平。基因陷阱（gene trap）是研究基因与调节元件功能的一个有力工具。目前已成功地应用于果蝇、小鼠、拟南芥等重要模式动植物的功能基因组研究(O'Brochta DA et aL, Proc NatL Acad Sci USA, 2011, 108(39): 16339-16344)，并发现了大量的新基因。本发明增强子样基因序列的筛选方法即采用了融合报告基因和基因陷阱的思路，增强子样序列诱捕载体以人乳头瘤病毒（Human PapiLLomavirus,HPV）58型主要衣壳蛋白L1基因和氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）融合表达作为报告基因，在增强子样序列插入时，菌株的氯霉素抗性提高，因而通过增加氯霉素浓度达到大规模筛选以获得相应的增强基因表达的序列。

目前发现的增强子样序列（enhancer-Like sequence，ERLS）主要应用在增强低分子量蛋白表达，例如干扰素，白细胞介素，本发明的报告基因需要表达较大融合蛋白基因（85KD），利用该融合基因筛选的序列也可构建一种高分子量蛋白表达系统，进而解决一些高分子量基因在外源表达系统中产率低的难题。大肠杆菌是重要基因工程菌，遗传背景清楚，操作简便、快速且成本低廉，成为筛选表达外源基因原核增强子样序列的首选。

因此，本发明将病毒衣壳蛋白与抗生素基因连接形成融合表达报告基因，发现的增强外源基因表达的增强子样基因序列ER1，可作为改善异源基因原核表达系统方面具有重要实用价值一种工具。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强外源蛋白表达的增强子样基因，旨在改进外源基因原核表达系统，该增强子样基因序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其截短序列。

本发明中所述增强子样基因截短序列为增强子样基因ER1任一长度的序列，如实施例7即为其截短序列，核苷酸序列为SEQ ID NO：1第99~516bp所示。

本发明首先抽提细菌基因组样品，细菌基因组源于昆明市呈贡区居民生活污水样品和昆明市第四十三解放军总医院附近污水处理厂污水样品中的细菌经富集抽提获得。基因组经酶切500bp以下DNA片段，并由此构建到增强子样序列筛选重组载体L1-CAT-pET21a启动子上游，构建基因文库，通过氯霉素抗性融合报告基因筛选含增强子样序列的菌株，之后，对菌株抗氯霉素抗性和增强子样序列进行了来源分析及其增强外源蛋白表达的能力进行检测。

本发明通过如下技术方案实现本发明目的：

（1）    构建含融合报告基因的重组筛选菌株