[发明专利]火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种用环介导等温扩增(Loop-mediated isothermalamplification，LAMP)技术快速检测火鸡组织滴虫的试剂盒，并涉及一种使用该种试剂盒快速检测火鸡组织滴虫的方法。

背景技术

组织滴虫病又称“黑头病”和“盲肠肝炎”，是由火鸡组织滴虫（Histomonas meleagridis）寄生于禽类引起的一种原虫病，以肝脏坏死、盲肠肿大和排硫磺样粪便为主要特征。目前，本病在中国和欧美等很多国家和地区流行严重，部分养殖场由于禽舍严重污染，常导致该病暴发，死亡率达到20-30%，再加上化学药物的治疗费用，造成的经济损失非常严重。

早发现和早治疗对于本病的控制十分重要。为了更好的控制组织滴虫病的传播和发病，并及时采取措施将其造成的经济损失控制在最小的范围，我们必须根据组织滴虫病的特点采取快速检测方案。

组织滴虫病的初步诊断主要依赖于临床症状的观察和剖检，由于肝脏和盲肠的病变有时容易与弧菌性肝炎、肿瘤、球虫病等禽病相混淆，因此建立一种敏感、可靠、实用的实验室诊断方法显得尤为紧迫和重要。目前，已报道的组织滴虫实验室诊断方法有：显微镜检查、组织病理学检查、虫体分离培养、聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay，ELISA)等，几种方法均可以直接检测出病料中的组织滴虫病病原，但显微镜检查时病原的形态与四毛滴虫、芽囊原虫等类似易混淆，组织病理学检查费时费力，虫体的分离培养又十分繁琐、耗时等，PCR、ELISA必须配备专用仪器，操作较为繁琐，常有非特异性出现，检测时间至少需要3个小时。与上述几种实验室诊断方法相比，LAMP技术对仪器设备要求不高，操作简单，临床上容易做到，检测时间也较短，不超过3小时，为快速、准确诊断鸡组织滴虫病病原提供了一种新方法。

发明内容

本发明的目的就在于克服其他检测方法的缺陷，研制一种火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒及其检测方法。

本发明的技术方案是：一种火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒，包括以下成分：

（1）反应液A：

含有10×等温反应缓冲液、Bst DNA聚合酶8000U/mL、l0mM dNTP、25mM MgCl₂、200μM内引物、200μM内引物2、l00μM外引物1、100μM外引物2、5M甜菜碱和去离子水，其中：

10×等温反应缓冲液含有200mM三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐（pH8.8）、100mM氯化钾、100mM硫酸铵、20mM硫酸镁和1%（m/V）曲拉通X-100（pH8.8，25℃）；

内引物1为:GAGCCCATGAACTATTGATTTCTCTAGTTCCTACCTTAAACTATGCC（SEQ ID NO.1）

内引物2为:CTACGACCGCAAGGCTGAAATTAAGCCACAAGCTCCAC(SQE ID NO.2)

外引物1为:GTATCCAACCGGATCAGAG(SEQ ID NO.3)

外引物2为:AAGTTTCCCCGTGTTGAT(SEQ ID NO.4)

（2）反应液B：1000×的荧光染料SYBR Green I。

本发明的另一技术方案是:

一种火鸡组织滴虫LAMP检测试剂盒检测火鸡组织滴虫的方法，其主要技术步骤包括：

(1)火鸡组织滴虫的环介导等温扩增

在装有24μL反应液A的PCR反应管中加入1μL待检样品处理液，混匀离心，将1μL的反应液B滴在PCR管盖内侧中间，轻轻盖紧管盖（小心操作，以防显色液坠入反应混合液中)，于60-65℃恒温水浴箱中放置60min。

(2)扩增产物的显色检测

反应结束后颠倒PCR管数次，使反应混合液与反应液B充分混合，肉眼观察反应液颜色，根据反应液的颜色变化判断检测结果。如颜色变为绿色，表明样品中含有火鸡组织滴虫，如颜色为黄色，说明待检样品不含有火鸡组织滴虫。