[发明专利]一种测定多糖蛋白结合物中游离多糖含量的方法

说明书

技术领域：

本发明涉及疫苗的检测，特别涉及一种多糖蛋白结合物中游离多糖含量的测定。

背景技术：

各种多糖疫苗的使用，有效地降低了相应传染病的发病率。但是由于荚膜多糖属于非T细胞依赖性抗原，不具备免疫记忆反应，且不能对2岁以下儿童产生保护性抗体，因此，其使用具有一定的局限性。研究表明，通过化学方法将蛋白载体共价结合于荚膜多糖上形成多糖蛋白结合物可以使之转化为T细胞依赖型抗原，从而可以提供对5岁以下婴幼儿的保护。

实验表明，多糖蛋白结合物中游离多糖含量的过高会导致疫苗中有效的抗原含量降低，对临床效果产生不利影响。另外根据欧洲药典的要求，也需要对多糖蛋白结合物中的游离多糖的含量进行测定。因此，游离多糖含量对于产品的质量控制是一个重要因素。

由于多糖种类以及多糖和蛋白的结合方式加之结合物的纯化方式的不同，目前还没有关于游离多糖含量测定的通用方法。我们通过实验证明，目前存在的一些测定游离多糖含量的方法，但分别具有一定的局限性，不能测定所有结合物中游离多糖的含量。国外有文献报道，可以在加入脱氧胆酸后，再加入盐酸(HCl)测定流感嗜血杆菌的多糖蛋白结合物中的游离多糖。我们用此方法测定肺炎多糖蛋白结合物原液中的游离多糖含量，效果不好，主要原因是加入HCl后不能将蛋白完全沉淀，因此导致游离糖含量测定结果有一定的偏差。还有文献报道利用乙醇沉淀法测定A群脑膜炎球菌多糖-破伤风类毒素结合物游离多糖的方法，该法耗时长，且步骤繁多，需要的样品量较大。根据文献资料，目前尚无利用三氯乙酸沉淀法测定多糖蛋白结合物原液中游离多糖含量的报道。

发明内容：

本发明公开一种多糖蛋白结合物中游离多糖含量的测定方法，该方法步骤如下：

1)取待测的多糖蛋白结合物原液，冰水浴条件下，加入脱氧胆酸钠溶液，充分混匀，静止；加入三氯乙酸溶液，混匀后低温离心；

2)取离心后的上清为测定样品A，取待测的结合物原液为待测样品B，利用化学方法或者免疫学方法分别测定样品A和样品B中的多糖含量为a和b；

3)多糖蛋白结合物中游离多糖的百分含量即为a/b×100％。

优选的，本发明的测定方法，步骤如下：

1)取待测的多糖蛋白结合物原液，冰水浴条件下，加入0.3％～3％的脱氧胆酸钠溶液，添加量为结合物原液体积的5％～15％，充分混匀，静止20min～40min；然后加入100％三氯乙酸溶液，添加量为结合物原液体积的0.1％-1％，混匀后4～8℃，8000rpm～12000rpm，离心15～20min；

2)取离心后的上清为测定样品A，取待测的结合物原液为待测样品B，利用化学方法或者免疫学方法分别测定样品A和样品B中的多糖含量为a和b；

3)多糖蛋白结合物中游离多糖含量即为a/b×100％。

特别优选的，本发明的测定方法，步骤如下：

1)取待测的多糖蛋白结合物原液，冰水浴条件下，1％脱氧胆酸钠溶液，添加量为结合物原液体积的10％，充分混匀，静止20min～40min；然后加入100％三氯乙酸溶液，添加量为结合物原液体积的0.5％，混匀后4℃，12000rpm，离心15min；

2)取上清为测定样品A，取待测的结合物原液为待测样品B，利用化学方法或者免疫学方法分别测定样品A和样品B中的多糖含量为a和b；

3)多糖蛋白结合物中游离多糖含量即为a/b×100％。

其中，所述多糖蛋白结合物为任意一种多糖蛋白结合疫苗，优选的是流感嗜血杆菌多糖蛋白结合物，肺炎链球菌多糖蛋白结合物，或者脑膜炎球菌多糖蛋白结合物。

其中，所述多糖蛋白结合物原液中多糖浓度为50-150ug/ml，优选的浓度为100ug/ml。

所述的肺炎链球菌多糖蛋白结合物为以下任意一种肺炎链球菌的多糖蛋白结合物：1型，2型，3型，4型，5型，6A型，6B型，7F型，8型，9V型，9N型，10A型，12F型，14型，15B型，17F型，18C型，19A型，19F型，20型，22F型，23F，33F型。

其中，步骤2中所述的化学方法包括硫酸蒽酮法、核糖测定法、磷含量测定法或者唾液酸测定法等，属于现有技术。

步骤2中所述的免疫学方法为酶联免疫吸附法或者免疫浊度法，属于现有技术。

另外，本发明所述的多糖蛋白结合物，按照本发明的步骤1的方法得到的上清样品A中的蛋白含量c，和多糖蛋白结合物原液B中的蛋白含量d，利用Lowry法或者BCA法测定的结果是；其中c/d<0.01。