[发明专利]显微镜照明系统及方法

说明书

技术领域

本发明涉及显微镜照明系统，以及提供用于定位显微镜的显微镜照明的相应方法，本发明特别地允许转换至用于扫描显微镜的不同照明模式，特别是用于共焦显微镜的不同照明模式。

背景技术

本发明涉及超分辨率定位显微镜方法的技术实施。这种方法的特征在于在获取图像时，仅有几个物点在给定的时间同时发射光线。如果这些点之间的间距显著地大于光学分辨率，则可通过数学质心确定方法来确定出这些点的位置，其精度高于所使用的物镜的光学分辨率。对许多不同物点的单个图像求和，最终能够得到整个物体的超分辨率图像。这种方法的已知变型体的区别在于它们确保了仅有几个物点同时发射光线。这种方法的名称例如是PALM，STORM和GSDIM。下文中将简要地描述最后一种方法。

GSDIM表示“跟随单个分子返回的基态损耗”。这种方法使用了具有三重态（也是“暗态”）的荧光体。最初，通过照射适当的激光能量，染料分子从基态迁移至激发态。然后从激发态迁移至三重态，三重态的寿命（约100ms）远长于激发单重态的寿命（仅约3ns），因此给定充足的光强，分子在三重态积聚。分子从三重态返回至基态，产生自发发射。记录这些自发发射的单个图像，通过前述精度高于光学分辨率的数学方法确定出这些自发发射的位置。分辨率可达到20-25nm，通常小于60nm。然而，可实现的分辨率同样也基于激光能量和所使用的摄像机的分辨率。

实施GSDIM的主要技术条件是采用高能量光使得样本产生荧光激发。这可以通过合适的激光照明来实现，其可以是由全内反射荧光显微镜（TIRF）照明装置提供的，该照明装置将激光光束聚焦至目镜的光瞳（目镜的后焦面）。这种方法的优点在于能够均匀地照明样本，且同时照明的景深比较大。为了最佳地使用激光的能量，激光光束的横截面被减少至照明的样本场仅是TIRF照明中的四分之一（例如，当采用100倍放大率的目镜时，照明的样本场的直径为约60μm，然而在TIRF照明中，该直径可达到约250μm）。

下文中，参考附图1a和1b来解释在TIRF照明和用于GSDIM的照明之间的转换方法。

以下是TIRF显微镜的一些最初观察。典型地，使用具有高数值孔径的油浸目镜的反转光显微镜来实现全反射需要的入射平角。在盖片和样本之间的界面上产生全反射。在盖片下的区域内形成所谓的瞬逝场。该场的光强以指数方式衰减进入样本。对于可见光，透入深度典型地为100-200nm。如果该区域中存在有能够吸收照射波长的光的荧光分子，则这些分子能够被激发以发射荧光。由于样本中可观察的层的厚度仅有100-200nm，因而沿光轴的分辨率显著地高于普通荧光显微镜（层区厚度典型地为500nm）的分辨率。在TIRF显微镜中，在目镜的边缘处耦合入激发光，从而其能够以需要的平角入射至盖片上。

附图1a示意性地示出具有照明光束16的典型的TIRF照明：光源18（典型地为激光器）发出的光线（由虚线表示）被准直光器件17准直。准直光被扫描目镜13聚焦。传送光器件14将焦点成像在目镜7的后焦面6上，此前光线被分束镜19反射。分束镜可提供诸如物理分离（physical separation），几何分离（geometrical separation），色彩分离（color separat ion）或偏振分离（polarization separation）。由于扫描目镜13难以被安装的尽可能靠近目镜7以直接聚焦在目镜的后焦面6上，则鉴于显微镜座的机械特性需要设置传送光器件14。为了使用具有不同后焦面位置的目镜，扫描目镜13是可聚焦的（由箭头指示）。目镜将聚焦在目镜7的后焦面6上的激光光束作为平行光束投射至样本8的空间（物空间）。该平行光束照亮样本8中直径为D_a（典型地约为250μm）的圆。

对于TIRF显微镜，关键的是扫描镜12（示意性地示出）是可倾斜的。通过倾斜扫描镜12（由两个箭头指示），焦点移动至垂直于目镜光轴的后焦面6。从而，激光光束穿过样本8的角度基于扫描镜12的倾斜。当这个角度大于盖片和样本媒质之间的全反射角，就是上述的TIRF显微镜。

以这种方式照亮的样本随后发射荧光（由实线表示）。该光线穿过分束器19并通过镜筒透镜21形成图像22。