[发明专利]一种脂肪酶及其重组表达工程菌株

说明书

技术领域

本发明属于微生物工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶基因及其重组表达工程菌株。

背景技术

脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。 脂肪酶基本组成单位仅为氨基酸，通常只有一条多肽链。它的催化活性仅仅决定于它的蛋白质结构（Schmid 等, 1998）。

脂肪酶广泛的存在于动植物和微生物中。植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽，当油料种子发芽时，脂肪酶能与其他的酶协同发挥作用催化分解油脂类物质生成糖类，提供种子生根发芽所必需的养料和能量；动物体内含脂肪酶较多的是高等动物的胰脏和脂肪组织，在肠液中含有少量的脂肪酶，用于补充胰脂肪酶对脂肪消化的不足，在肉食动物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在动物体内，各类脂肪酶控制着消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代谢等过程；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富（Pandey等）。由于微生物种类多、繁殖快、易发生遗传变异，具有比动植物更广的作用p H、作用温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，适合于工业化大生产和获得高纯度样品，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，并且在理论研究方面也具有重要的意义。

脂肪酶具有广泛的应用价值，已成为市场上的第三大工业用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于饲料添加剂、油脂加工、食品、医药、日化等工业。脂肪酶的制备方法有提取法和微生物发酵法（王海燕等，2007，饲料工业）。但是提取法工艺复杂，成本高、效率低。因此，绝大多数脂肪酶均是通过微生物发酵而制备的。现有工业化生产脂肪酶的方法主要有二种：一是诱变选育高产的脂肪酶的自然菌株，如解脂亚罗酵母（李珍等，2011，菌物学报；徐宇丽等，2011，微生物学报）；二是构建高产的工程菌（王小峰等，2011，生物工程杂志）。

构建基因工程菌是获得高产、高酶活菌株的有效方法之一。目前国内市场上脂肪酶产品多由毕赤酵母异源表达而生产，其优点是发酵工艺成熟；缺点是甲醇诱导存在的安全隐患，还有毕赤酵母表达水平不高，表达水平一般低于7g/l。

木霉最常用的工业酶生产菌株之一，其中市场上的纤维素酶绝大多数是由木霉生产的。木霉属于真核生物，具有翻译后修饰系统，如内含子的剪切和糖基化等，因此可以直接表达真核来源的DNA序列、无需删除内含子序列，简化了分子操作。木霉规模化发酵系统优点是：（1）分泌表达，便于发酵后处理；（2）深层液体发酵，便于规模化工业发酵；（3）高密度发酵，生产成本低，其最高表达水平可达40g/l。

因此，通过构建木霉工程菌，高效重组表达脂肪酶，有望大大降低发酵成本，从而降低脂肪酶对使用成本，促进脂肪酶在饲料添加剂领域的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种脂肪酶及其重组表达工程菌株，即一种从黑曲霉中筛选的新的脂肪酶，以及用于重组表达该脂肪酶的里氏木霉工程菌，经里氏木霉表达后，该酶对胃液、胃蛋白酶和人工肠液的耐受性增强，可将其广泛用作饲料添加剂，提高饲料利用率。 

本发明首先提供一种新型的脂肪酶，其特征在于：

（a）其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的脂肪酶；

（b）在（a）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。

用于编码上述脂肪酶的基因，其中一种核苷酸序列是SEQ ID NO:2。

本发明另一方面提供了一种里氏木霉工程菌，用于表达上述的脂肪酶。

所述里氏木霉工程菌ZQ-1（Trichoderma reesei ZQ-1），已于2012年11月27日保藏于“中国典型培养物保藏中心”，保藏编号是：CCTCC NO:M 2012483。

本发明的脂肪酶作为饲料添加剂的应用。

本发明的里氏木霉工程菌能高效表达黑曲霉来源的脂肪酶，20L罐发酵酶活高达20000U/ml，表达水平超过10g/L。经里氏木霉宿主细胞的修饰，本发明的里氏木霉工程菌重组表达的脂肪酶对胃液、胃蛋白酶和人工肠液的耐受性很强，适合作为饲料添加剂使用。

附图说明

图1 ：本发明的里氏木霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图。

图2 ：本发明重组表达脂肪酶的耐受性实验。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1 黑曲霉脂肪酶基因表达载体的构建

1.1 提取黑曲霉总基因组DNA