[发明专利]O型口蹄疫病毒耐酸突变株、其携带的衣壳蛋白及其编码基因和应用

说明书

技术领域

本发明涉及口蹄疫病毒耐酸突变株及其携带的衣壳蛋白和编码基因，尤其涉及O型口蹄疫病毒耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆以及用该O型口蹄疫病毒耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆所拯救的O型口蹄疫病毒耐酸突变株，本发明还涉及决定O型口蹄疫病毒耐酸毒株耐酸特性的VP1 N17D突变位点及应用，属于口蹄疫病毒防治领域。

背景技术

口蹄疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot and Mouth DiseaseVirus,FMDV）引起的，主要侵害偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。该病一旦爆发会对社会经济造成严重影响，因此在国际上被称为政治经济病，历来受到各国政府的高度重视。

FMDV是微RNA病毒科口蹄疫病毒属成员，属于单股正链RNA病毒。FMDV对酸高度敏感，最适PH值为7.4-7.6，在PH值略低于中性条件下衣壳即会解聚。FMDV的酸敏感性是病毒衣壳裂解所必需的，病毒进入细胞后内体的酸性环境诱导衣壳分解，从而使RNA基因组在感染的细胞中释放（Carrillo et al.,1985）。FMDV利用内体酸化作用进行脱壳的现象虽然很早就被发现，但是酸介导FMDV脱壳的分子机制至今尚不清楚。

口蹄疫病毒对酸敏感的特性一直是灭活疫苗生产中的技术难题。对于口蹄疫疫苗来说，146S病毒粒子是灭活疫苗诱导中和抗体的最有效抗原。然而，由于FMDV对酸性环境极其敏感，在体外繁殖FMDV时，细胞代谢产酸很容易使得FMDV培养环境的pH下降，当pH值略低于中性条件时，FMDV的衣壳就会裂解，导致FMDV的有效抗原量降低，由此制备的灭活疫苗其免疫效力就会下降（Doel,T.R.,and W.K.Chong.1982.Comparative immunogenicity of 146S,75S and 12S particles of foot-and-mouth diseasevirus.Arch Virol 73:185-191.）。此外，FMDV衣壳对温度也比较敏感，造成FMDV灭活疫苗运输和储存过程中需要完善的冷链系统，导致成本大幅上升。因此，开发高度耐酸的口蹄疫疫苗株对提高灭活疫苗免疫效力具有重要意义。

发明内容

本发明目的之一是构建O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆；

本发明目的之二是提供用所述O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆拯救的O型口蹄疫病毒耐酸突变株病毒；

本发明目的之三是提供决定O型口蹄疫病毒耐酸特性的关键氨基酸；

本发明目的之四是将所述的O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒及所拯救的耐酸突变株病毒应用于预防或治疗口蹄疫领域。

本发明目的之五是将决定O型口蹄疫病毒耐酸特性的关键氨基酸应用于预防或治疗口蹄疫领域。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆（pYS-N17D），所述O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA质粒克隆的核苷酸全长序列为SEQ ID No.1所示;其微生物保藏编号为：CGMCC NO.6868；保藏时间为：2012年11月22日；该重组质粒的分类命名为：O型FMDV耐酸突变株感染性cDNA克隆质粒pYS-N17D；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

本发明首先将O型FMDV O/YS/CHA/05株在酸压力下进行传代连续传15代，筛选获得一株具有高度耐酸特性的O型FMDV突变株，将其命名为O-AR株,该突变株所携带的衣壳蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.3所示，其编码基因为SEQ ID No.2所示。本发明分别提取酸压力筛选获得的O型口蹄疫病毒P5、P10和P15三个代次的病毒RNA，对这三个代次病毒的耐酸性进行比较。试验结果发现，P5、P10和P15毒株均为O型FMDV耐酸毒株且具有相似的耐酸特性，这表明亲本毒株在体外筛选至第5代即获得耐酸表型，并且这种耐酸表型稳定存在至第15代。