[发明专利]一种靶向人核仁蛋白hRrp15 esiRNA的制备方法及应用

权利要求书

1.一种制备人核仁蛋白hRrp15 esiRNA的特异性引物，其特征在于它具有

上游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGGTCATCCTCTGATAGTTGGGG

下游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGAATCATATCTTCCAGATTACC。

2.一种采用权利要求1所述的特异性引物制备人核仁蛋白hRrp15 esiRNA的方法，其特征在于按如下的步骤进行：

（1）设计PCR引物：

将hRrp15基因序列与人类基因组序列进行比对，并找到hRrp15基因的3'UTR序列，在3'UTR区域设计一段5’端含有T7启动子序列的PCR引物：

上游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGGTCATCCTCTGATAGTTGGGG

下游引物：AGTTAATACGACTCACTATAGGGAATCATATCTTCCAGATTACC；

（2）T7-hRrp15 3'UTR dsDNA的制备：

以293T 细胞基因组为模板PCR扩增，50μl反应体系：

基因组DNA（0.5μg/μl）：0.5μl

10×PCR buffer：5μl

each 2mM dNTPs：5μl

25mM MgCl₂：3μl

10μM上游引物：3μl

10μM下游引物：3μl

高压去离子水：29.5μl

Taq DNA聚合酶（5U/μl）：1μl，见图10；

（3）T7-hRrp15 3'UTR dsDNA的纯化：

琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒纯化T7-hRrp15 3'UTR dsDNA，得到纯化的体外转录模板，将纯化的片段溶于40μl高压去离子水里，并进行琼脂糖凝胶电泳，验证得到纯化产物；

（4）T7-hRrp15 3'UTR dsRNA的制备：

纯化的T7-hRrp15 3'UTR dsDNA体外转录，50μl转录体系：

100ng/μl T7-hRrp15 3'UTR dsDNA：20μl

10×buffer：5μl

0.1M NTPs：4μl

50U/μl T7 RNA聚合酶：1μl

0.1M DTT：1μl

DEPC水：29μl

37℃水浴过夜，12-16h

反应结束后向转录产物中加入1μl RNase-free DNaseⅠ（1U/μl），37℃水浴作用15min，作用后75℃煮5min，取出转录产物放置至室温30min，将反应后产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证得到转录产物；

（5）LiCl沉淀法纯化T7-hRrp15 3'UTR dsRNA：

上述所得的50μl转录反应体系中加入150μl LiCl（7.5M LiCl+0.5mM EDTA混合物），-20℃沉淀过夜，13200rpm，4℃离心20min，用枪头轻轻吸掉上清，加入冷的75%乙醇，13200rpm，4℃离心20min洗沉淀，吸弃上清，60℃烘箱烘干沉淀，加入50μl高压去离子水溶解沉淀，应用紫外分光光度计测得纯化产物浓度约为450ng/μl；

（6）T7-hRrp15 3'UTR esiRNA的制备：

将上述得到的纯化的T7-hRrp15 3'UTR dsRNA进行GST-RNaseⅢ 大量酶切，100μl体系：

450ng/μl T7-hRrp15 3'UTR dsRNA：50μl

10×buffer：10μl

1.66μg/μl GST-RNaseⅢ：2μl

0.1M DTT：1μl

DEPC水：37μl

37℃水浴作用3h

4% 低熔点琼脂糖凝胶电泳鉴定T7-hRrp15 3'UTR esiRNA；

（7）T7-hRrp15 3'UTR esiRNA的纯化：

在上述酶切反应中加入5μl 0.5M EDTA终止酶切反应，加入500 μl of IPN buffer in QIAquick Nucleotide Removal Kit from QIAGEN Inc，并将总反应体系过柱，6000rpm离心1min，将柱子收集管中的液体转入到新离心管中，并加入等体积的异丙醇，室温沉淀esiRNA 2h，13200rpm，4℃离心20min，弃去上清，加入冷的75%乙醇洗沉淀一次，13200rpm，4℃离心20min，吸弃上清，60℃烘箱烘干沉淀，加入50μl高压去离子水溶解沉淀，应用紫外分光光度计测得纯化产物浓度约为350ng/μl。