[发明专利]人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法

权利要求书

1.一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于：步骤如下：

（1）人角膜基质成纤维细胞的原代培养：将新鲜人角膜环浸于含100U/ml青霉素-100U/ml链霉素的平衡盐溶液冲洗消毒，置于倒置显微镜下，上皮刀刮除角膜上皮，显微镊子撕除后弹力层及内皮，剩余角膜基质用显微剪剪成1mm×1mm组织块，均匀贴壁于培养皿，待贴壁牢固后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO₂孵箱内孵育培养，每3天更换一次培养基；待细胞铺满培养皿底部70%～80%时1：2传代培养；传代培养至第四代，加入上述培养基及丝裂霉素C，抑制2小时，获得人角膜基质成纤维细胞层；

（2）常规原代培养小鼠胚胎成纤维细胞，取其3～4代作为饲养层，采用人胚胎干细胞培养基常规培养人胚胎干细胞，机械法分选形态状态良好的人胚胎干细胞克隆团，按照8～12个克隆/cm²密度接种于步骤（1）制备的人角膜基质成纤维细胞层上，采用不含bFGF的人胚胎干细胞培养基培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，机械法将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至10ug/ml纤维连接蛋白包被的培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞；

（3）人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞：将步骤（2）分选出的人神经嵴干细胞用人角膜内皮细胞条件培养基重悬，加入经10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，置于37℃、5%CO₂孵箱孵育培养，隔天更换人角膜内皮细胞条件培养基，培养至细胞基本长满，互相间形成紧密连接呈多边形单层排列，即得人角膜内皮细胞。

2.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于：所述人胚胎干细胞培养基是在DMEM knock out基础培养基上添加以下物质制成的：knock out血清替代物，巯基乙醇，谷氨酰胺，非必需氨基酸，碱性成纤维细胞生长因子；添加后，knock out血清替代物占总液体量的20%，巯基乙醇的浓度为0.1mM，谷氨酰胺的浓度为0.1mM，非必需氨基酸的浓度为0.1mM，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为4ng/ml。

3.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于：所述形态状态良好的人胚胎干细胞是指：圆形或类圆形、边缘光滑、细胞排列紧密均质、未分化的人胚胎干细胞。

4.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于：所述神经嵴干细胞培养基是在DMEM/F12培养基上添加以下物质制成的：B27，ITS,EGF，bFGF和NGF；添加后各物质的终浓度分别为：B27占总液体量的2%，ITS占总液体量的1%,EGF20ng/ml，bFGF 10ng/ml，NGF 10ng/ml。

5.根据权利要求1所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于：所述人角膜内皮细胞条件培养基是通过以下方法制备得到的：

（1）人角膜内皮细胞B4G12细胞系的培养：将装有B4G12细胞的冻存管从超低温冰箱取出，迅速转移至37℃水浴锅内将管内冰块溶解，将冻存管内细胞悬液移至离心管内，加入5mlB4G12细胞培养基，1000转/分钟离心5分钟后弃上清，再加入4ml B4G12细胞培养基重悬细胞沉淀，最后将细胞加入10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，采用B4G12细胞培养基培养，隔日换液；

（2）条件培养基的制备：观察B4G12细胞生长，至其铺满培养瓶底部70～90%满时，更换新鲜培养基继续培养12小时，收集细胞培养上清液，用0.22μm滤器过滤后-80℃保存备用；待收集完成后，将该收集的上清液与含有10%胎牛血清DMEM/F12培养基按照体积比3：1的比例混合配制成上清液浓度为75%的人角膜内皮细胞条件培养基，4℃保存备用。

6.根据权利要求5所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于：所述B4G12细胞培养基是在人内皮无血清培养基的基础上添加10ng/mlbFGF制成的。

7.利用权利要求1～6中任一项所述的人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法得到的角膜内皮细胞。

8.权利要求7所述的角膜内皮细胞作为种子细胞用于组织工程角膜构建及移植的应用。