[发明专利]一种融合蛋白的纯化和复性方法

说明书

本发明提供一种融合蛋白的纯化和复性方法，包括以下几个步骤：蛋白质的纯化、样品稀释、膜包准备、浓缩和置换步骤。本发明的有益效果是：本方法可工业化放大、纯化后得到的纯度是在蛋白得率高的情况下，纯度也高，并且还具有稳定的抗原活性。

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白的制备方法，尤其涉及一种适合工业化且低成本的Mtb72f融合蛋白包涵体的制备方法。

背景技术

目前来说，高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌在大量合成异源蛋白质时，一般情况下以包涵体的形式存在于细菌内。包涵体由高度聚集的外源蛋白质、核酸及蛋白质合成酶及核糖体组成。其中大部分（50%以上）是克隆外源基因的表达产物，它们具有工程菌表达的外源基因的正确的氨基酸序列，但空间构象往往是错误的，因而没有生物活性。由于包涵体位于细菌细胞内且没有生物活性，需经细胞裂解后经提取洗涤后变性复性及纯化步骤方能得到有活性的蛋白质。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种融合蛋白的纯化和复性方法，包括以下几个步骤：蛋白质的纯化、样品稀释、膜包准备、浓缩和置换步骤。

优选的，所述蛋白质的纯化步骤包括：将包涵体变性液上样到含Q-Sepharose F.F柱子，用平衡缓冲液A清洗后，用洗脱缓冲液B洗脱目标峰，再将来自Q-Sepharose F.F柱子上的洗脱峰上样到事先用平衡缓冲液C平衡好的含有陶瓷基质羟基磷灰石的柱子，收集含有Mtb72f的穿透峰；其中，所述平衡缓冲液A为：50mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0；

缓冲液B为：90 mM NaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0；平衡缓冲液C为：250mMNaCl,20mM Bis-Tris,6M 尿素，pH=7.0。

优选的，所述样品稀释步骤包括：用紫外分光光度计测定穿透峰的浓度，用洗脱缓冲液B稀释至 0.2-0.3g/L。

优选的，所述膜包准备步骤包括：用NaOH 溶液循环清洗Centramate膜包，再用Na₂HPO₄清洗2次，再用平衡缓冲液C清洗至渗出液pH值为7.0±0.10。

优选的，所述浓缩和置换步骤包括：

1）将稀释后的穿透峰浓缩至1.1-1.6g/L,循环流速为6L/min/ M²，每分钟的渗析流速控制在浓缩后料液体积的1/18，将样品超滤浓缩至浓度为3.0-3.8g/L。

2）将步骤1所得到的样品用Tris缓冲液进行透析置换，透析过程中，循环速度保持在6L/min/ M²，渗析速度与第一次浓缩时一致，加缓冲液的速度与渗析速度相同。

3）将步骤2所得到的样品浓缩至步骤1的浓缩体积的0.38-0.40倍。循环速度和渗析速度同前。

4）以步骤3中用Tris缓冲液透析处理，透析过程中，循环速度保持在6L/min/ M²。循环速度和渗析速度同前，样品加缓冲液速度与渗析液的速度一致。

5）收集步骤4的浓缩液，再将所述膜包用20mM、pH=7.5的Tris缓冲液清洗，共清洗3次，收集滤出液，每次用量皆为5L/M²膜面积。将3次滤出液加至步骤4的浓缩液混匀后检测蛋白浓度，添加20mM、pH=7.5的Tris缓冲液，使样品蛋白终浓度=2.0mg/mL。

优选的，还包括无菌过滤步骤：将步骤5得到的样品用0.22 µm滤器进行无菌过滤即得到纯化原液，纯化原液分装于无菌无热原的PEG瓶中，–70℃以下保存。