[发明专利]一种具抗凝活性的菲牛蛭素多肽及其制备方法与用途

权利要求书

1.一种菲牛蛭素活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.编码权利要求1所述菲牛蛭素活性肽的基因。

3.根据权利要求2所述基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.权利要求1所述的菲牛蛭素活性肽的制备方法。

5.根据权利要求4所述的制备方法，包含以下步骤：

步骤1：以编码权利要求1所述菲牛蛭素活性肽的cDNA为模板；设计引物进行PCR扩增，上游引物如SEQ ID No.3所示，下游引物如SEQ ID No.4所示；

步骤2：对扩增产物与质粒进行重组构建原核表达载体；将所得原核表达载体转入宿主细胞E.coli BL21（DE3）进行蛋白表达；

步骤3：收集菌体，离心弃沉淀，收上清；向上清中加硫酸铵达硫酸铵浓度65-80%，静置后离心弃上清，取沉淀用pH 7.4 PBS溶解；

步骤4：将步骤3所得溶解液超滤除杂，用0.1M NaCl溶液洗膜，收集穿过液；穿过液用G-25柱脱盐，收集层析图谱中第一个吸收峰，即得。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述模板的核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述质粒为pET22b。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述蛋白表达经IPTG诱导。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述PCR扩增反应条件为：95℃ 5min；94℃ 30 s，55℃ 60 s，72℃ 45 s，30次；72℃ 10min。

10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述超滤为用0.45 μm醋酸纤维滤膜过滤后，用30 kDa超滤管，于4℃、4000 rpm进行超滤。

11.临床制剂，包括权利要求1所述的菲牛蛭素活性肽及药学上可接受的辅料。

12.根据权利要求11所述的临床制剂，其特征在于，其为口服制剂或注射制剂。

13.根据权利要求12所述的临床制剂，其特征在于，所述口服制剂为胶囊剂或片剂、颗粒剂；所述注射制剂为注射液或冻干粉针剂。

14.权利要求1所述菲牛蛭素活性肽在制备抗凝药物中的用途。