[发明专利]人胚皮层神经干细胞的原代细胞的分离及传代培养方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种神经干细胞的原代细胞的分离培养、单细胞克隆以及传代培养方法，其应用于神经干细胞的细胞株的克隆培养过程。

背景技术

神经干细胞的发现是神经科学领域的重大突破，为神经发育和神经组织移植等研究领域开辟了广阔前景。神经干细胞是一种具有自我更新及广泛分化潜能的细胞，它处于分化的非终末状态，可通过对称或不对称分裂出新的干细胞或分化潜能逐渐变小的子细胞，最终产生中枢神经系统的三种主要细胞，即神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞。一般认为神经干细胞主要存在于哺乳动物胎脑的纹状体、小脑半球、脑室区等，成年哺乳动物脑的侧脑室壁和海马等区。有关哺乳动物胚胎阶段和成年动物在特定脑区存在神经干细胞已不断得到证实，但对人类神经干细胞的研究尚少。

发明内容

为获得大量、稳定的神经干细胞，本发明提出一种神经干细胞单细胞克隆及传代培养方法，利用无血清培养和单细胞克隆技术在人胚皮层中分离具有单细胞克隆能力的细胞，并进行培养、传代，贴壁分化观察，采用间接免疫荧光检测克隆细胞的神经巢蛋白(Nestin)抗原和分化后特异性成熟神经细胞抗原的表达予以鉴定。

具体的，为实现本发明的目的，所述的神经干细胞的原代细胞的分离及传代培养方法包括以下步骤：原代细胞的分离和培养，传代培养及单细胞克隆、传代，克隆诱导分化以及间接免疫荧光检测；其中，

所述原代细胞的分离和培养步骤具体为：取胚龄12周水囊引产的新鲜人胚胎，在无菌条件下分离出胎脑大脑皮层，剥离硬膜及表面血管，在DMEM/F12(1∶1)的细胞培养液中漂洗三次，用细吸管反复吹打瓶内组织碎块至完全散开，制成细胞悬液，经100目不锈钢网过滤，制成单细胞悬液，经分胎蓝染色计数活细胞加入含B₂₇和bFGF的DMEM/F12无血清培养液，调整细胞含量为1×10⁵ml^-1，将细胞悬液分装于25ml细胞培养瓶，每瓶3ml，37℃，5％CO₂条件下静置培养7天；

所述传代培养及单细胞克隆、传代的步骤具体为：将原代培养7天后的细胞克隆悬液用吸管轻柔吹打进行机械分离，制成单细胞悬液，用含B₂₇和bFGF的无血清培养液将细胞悬液按1×10⁴ml^-1浓度传代接种于培养瓶，在37℃，5％CO₂条件下静置培养7天，同时进行克隆形成实验，计数每代的克隆形成率，每7-9天机械分离传代；然后采用有限稀释法将原代克隆细胞制成的单细胞悬液，稀释到40ml^-1，于96孔培养板中滴加稀释的细胞悬液，选取仅有一个细胞的培养孔作记号，并动态观察；待长成单细胞克隆球后机械分离成单细胞悬液，再将一个克隆的所有细胞种至培养瓶中，待次代克隆长成后连续传代，最后得到多个来自某单个细胞的亚克隆；

所述克隆诱导分化的步骤具体为：分别选取部分传代及单细胞克隆的细胞种植于多个多聚赖氨酸包被的玻片上，并加入含血清培养基，观察其生长分化情况，分别于7天、14天行免疫荧光检测；

所述间接免疫荧光检测的步骤具体为：将克隆细胞滴至多聚赖氨酸包被的玻片上，贴壁12小时后用4％多聚甲醛固定，进行神经巢蛋白n抗体免疫荧光染色；分别将传代及单细胞克隆的细胞种植于预置多聚赖氨酸包被玻片的含血清培养集中，于7天、14天时取出，进行Nestin、NeuN、GFAP、CNP抗体的免疫荧光单标染色及NeuN和CNP抗体的免疫荧光双标染色。

本发明采用无血清培养和单细胞克隆技术从从胚龄12周的新鲜人胚皮层中成功建立一株人胚神经干细胞，该细胞具有连续克隆能力，可传达培养，表达神经巢蛋白抗原。分化后的细胞表达神经元细胞、胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。

附图说明

通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中：

图1所示为本发明的神经干细胞单细胞克隆细胞株的分离培养方法的步骤流程图。

具体实施方式

如图1所示的本发明的神经干细胞原代细胞的分离及传代培养方法的步骤流程图，其应用于神经干细胞单细胞克隆细胞株的分离培养过程，所述方法包括以下步骤：