[发明专利]人类羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的构建方法

权利要求书

1.一种在体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其包括如下步骤：

S1：羊膜上皮细胞的分离培养:取乙肝表面抗原及HIV抗体检测均阴性的孕妇剖宫产手术后获取的羊膜，大小约15×15cm，分离、去除残存的绒毛膜，PBS反复冲洗，直到洗尽血性液，将羊膜剪碎成直径约1-2mm左右的小碎片，倒入有盖玻璃皿中，分别加入0.25%胰酶和EDTA各15ml，37℃消化7-8分钟，用PBS液100ml稀释后经200目滤网过滤，同时在滤液中加入含5%FBS培养液终止消化，1000rpm离心6min收集细胞，接种在含10%FBS的RPMI1640的培养皿中，于37℃含5%CO2的培养箱内培养。

S2：原代细胞的纯化:对原代细胞分离培养至7天后进行纯化，（1）在培养液中加入Ara-C,作用浓度为10^-6mol/L，作用时间为36h。（2）更换新鲜培养基继续培养1d。（3）再次向培养皿中加入Ara-C,作用浓度为10^-7mol/L，作用时间为12h。（4）更换新鲜培养基继续培养1d。（5）弃培养基，D-Hank清洗细胞2次，0.25%胰酶消化5min，FCS终止消化，800R/min离心5min，弃上清后全培养基继续培养。

S3：原代细胞的鉴定:取上述纯化后的细胞继续培养3d后，用胰酶消化，PBS液调整细胞浓度为1×10⁶/ml，分别加入下列鼠抗人单克隆抗体：CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置4°C孵育30min，PBS洗2遍，直接进行流式细胞仪分析。

S4：羊膜细胞丝素蛋白支架复合体的构建:将上述体外培养并经过纯化后的羊膜上皮细胞调整浓度为1×10⁶/ml，将细胞悬液滴在灭菌处理过的丝素蛋白支架上，放入24孔培养板中悬空孵育4小时，待细胞充分吸附在支架上后再加入10%FBS+RPMI1640全培养基，令细胞完全浸没，2到3天半量换液，每天进行倒置显微镜下观察细胞贴壁及生长情况。

S5：扫描电镜观察:第十天取出支架复合物标本放入2.5%戊二醛固定，PBS冲洗后，常规脱水，临界点干燥喷金在扫描电镜下观察细胞的生长情况。

2.如权利要求1所述的体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其中所述步骤3为明确原代细胞的性质，除了对纯化后的细胞进行流式细胞仪检测，同时取少量细胞进行特异性细胞表面标记物免疫荧光染色测定及应用焦油紫染色观察细胞形态。

3.如权利要求1所述的体外构建羊膜上皮细胞与丝素蛋白支架复合体的方法，其中所述步骤4所用的丝素蛋白支架系苏州大学材料学院提供，丝素蛋白来源于蚕丝，是一种具有良好生物相容性和生物降解性的细胞外基质材料，具有理想的三维空间构型，为细胞的停泊、生长、繁衍、新陈代谢、新组织的形成提供支持。该支架的降解产物不对细胞繁殖产生不利影响，其降解速度与细胞的增殖速度相匹配，并具有一定的柔韧性，使之既能通机体组织合并贴合，又不会对机体组织造成机械损伤。