[发明专利]一种小麦遗传转化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法。

背景技术

小麦是世界上最重要的粮食作物之一，是仅次于水稻的第二大粮食作物，在世界各地都被广泛种植。小麦是我国人民赖以为生的农作物，随着我国人口的增加和人民生活水平的提高，对小麦的产量和品质也提出了越来越高的要求。传统的常规育种已经不能满足对小麦的品种和品质的要求，转基因技术的发展打破了常规育种的限制，已经成功地在棉花、玉米、大豆、油菜等作物中培育出高产新品种，创造了良好的经济效益和社会效益。小麦由于转化效率较低，转基因株系较难获得，因而与其它作物相比分子育种相对落后。

目前小麦的转化方法主要有花粉管通道法、基因枪法、农杆菌法、电激转化法和PEG法。由于小麦原生质体再生困难,所以限制了电激转化法和PEG转化法的应用。

花粉管通道介导的遗传转化是在植物授粉后将外源DNA片段通过花粉管通道导入胚囊，从而整合到受精卵基因组中，然后发育成种子。花粉管通道法简单易行，但转化后代性状变异复杂，后期筛选工作很困难，因而一直没有被广泛使用。农杆菌介导的小麦遗传转化一直是植物界研究的一道难题。人们对影响农杆菌介导小麦遗传转化的因素作了深入广泛的研究，包括小麦基因型、外植体源、预培养时间、侵染和共培养时间、乙酰丁香酮、农杆菌菌株、载体以及筛选剂等都会影响转化率。农杆菌法具有转基因低拷贝、遗传稳定、能够转化相对较大片段DNA以及成本低廉等优点，但存在受基因型限制、对组织培养技术依赖性强、转化频率不高以及起始外植体单一等问题，因而应用受到一定的限制。

基因枪法是小麦转化中应用较为广泛的一种转化方法。基因枪转化法是借助高速运动的金属微粒使附着于其表面的核酸分子穿过受体的细胞壁,释放出的DNA分子，并且随机整合到植物基因组中,然后通过组织培养技术再生出植株。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法。

本发明提供的小麦遗传转化方法，包括如下步骤：

（1）将小麦胚性愈伤组织进行预培养；

（2）将含有目的基因的表达载体通过基因枪法导入完成步骤（1）的胚性愈伤组织；所述表达载体含有潮霉素抗性基因；

（3）将完成步骤（2）的胚性愈伤组织进行恢复培养；

（4）取完成步骤（3）的胚性愈伤组织，在筛选培养基上培养35-55天（可为35-45天、45-55天、35天、45天或55天）；所述筛选培养基中含有35-45mg·L^-1（可为37-43mg·L^-1、37-40mg·L^-1、40-43mg·L^-1、37mg·L^-1、40mg·L^-1或43mg·L^-1）的潮霉素；

（5）取步骤（4）得到的胚性愈伤组织，在含有35-45mg·L^-1（可为37-43mg·L^-1、37-40mg·L^-1、40-43mg·L^-1、37mg·L^-1、40mg·L^-1或43mg·L^-1）潮霉素的分化培养基上培养10-20天（可为10-15天、15-20天、10天、15天或20天），得到产生芽点的胚性愈伤组织；

（6）取步骤（5）得到的产生芽点的胚性愈伤组织，在含有15-25mg·L^-1（可为17-23mg·L^-1、17-20mg·L^-1、20-23mg·L^-1、17mg·L^-1、20mg·L^-1或23mg·L^-1）潮霉素的分化培养基上培养30-60天（可为30-47天、47-60天、30天、47天或60天），得到小苗；

（7）取步骤（6）得到的小苗，在生根培养基上培养至生根。

所述步骤（1）中，所述预培养采用的培养基可为高渗培养基。

所述步骤（1）中，所述预培养的条件为：25℃黑暗培养4小时。