[发明专利]人羊膜间充质干细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域的一种培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的方法，特别涉及一种采用酶消化法联合表皮生长因子(EGF)来培养人羊膜间充质干细胞的过程中的人羊膜间充质干细胞的分离方法。

背景技术

正常人羊膜组织结构分为上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维细胞层及海绵层，其中人羊膜间充质干细胞(human amnion membranemesenchymal stem cells，hAMSCs)位于羊膜的最内层，是在受精后第8天从外胚叶发育而来，使其可能维持原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性，拥有更大的多向分化潜能，hAMSCs理论上可以分化成各种组织细胞，同时因羊膜获得方便且回避了伦理学争议，有潜力成为未来临床应用的干细胞来源之一。hAMSCs原代培养分为组织块培养和酶消化法培养，组织块培养由于不是每个组织块都能培养成功，且容易混杂有成纤维细胞污染，培养形成单层的时间较长，不利于快速大量获取细胞，难以满足干细胞研究的需要；酶消化法鉴于羊膜组织结构致密，结构致密，用酶一次消化时间过长对细胞损伤较大，时间太短得到的细胞数量太少。因此有必要建立一种在体外分离、纯化并大量扩增和诱导分化hAMSCs的方法。

发明内容

为建立一种在体外分离、纯化并大量扩增和诱导分化hAMSCs的方法，本发明提供一种采用酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞的方法，通过采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，此时的羊膜细胞是上皮细胞、间质干细胞、成纤维细胞等多种细胞的混合物，加入表皮生长因子(EGF)，将贴壁培养和消化时间控制相结合，可获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞。

具体的，本发明的酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的方法包括如下步骤：hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测。

其中，所述hAMSCs的分离步骤包括：无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hanks液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约1mm³碎块，加入胰蛋白酶37℃消化10分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入II型胶原酶消化液，37℃消化30分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；1000转/分钟离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为1×10⁶/ml，接种至培养瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培养基；置37℃、饱和湿度、体积分数5％的CO₂培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液1次，并摄片记录；待细胞汇合度达80％后，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA溶液于37℃消化2-3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以1×10⁷/ml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液1次，待细胞长满70％瓶底重复以上步骤。

所述hAMSCs的原代培养步骤包括：将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000rpm离心15分钟，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500转/分钟进行15分钟洗涤，收集细胞；接种细胞前吸取FBS加入细胞培养瓶，置37℃，5％CO₂，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20％FBS，4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.0×10⁶细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37℃，5％CO²，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80-90％汇合时，以0.25％胰蛋白酶-0.01％EDTA消化，所得细胞为原代细胞。