[发明专利]一种检测雌激素受体对阴茎血管内皮细胞保护作用的方法

权利要求书

1.一种检测雌激素受体对阴茎血管内皮细胞保护作用的方法，首先将组织做成石蜡切片，再通过免疫组化三步法进行染色显色。

2.根据权利要求1所述检测雌激素受体对阴茎血管内皮细胞保护作用的方法，包括如下步骤：

（一）、石蜡切片制作

（1）固定：选择刚刚死亡的ERβ缺陷型动物和正常动物，取部分阴茎中段组织，用PBS冲洗，放入固定液4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h；

（2）脱水：倒去固定液，将组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水：70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精Ⅰ、无水酒精Ⅱ各2h；

（3）透明：脱水后的组织于体积比为1:1的无水酒精和二甲苯混合液内透明45min，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ内透明各30min；

（4）包埋：恒温箱内将透明后的组织浸入石蜡，58℃的体积比为1:1二甲苯和石蜡混合液45min，石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ共2.5h后，用石蜡Ⅲ包埋组织；

（5）切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成3-5μm的石蜡带；

（6）贴片：将石蜡带在50℃温水中展片，然后预处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上；      

（7）烤片：68℃恒温箱内烤带有组织带的载玻片2h；

(二)、免疫组化SP三步法

（1）脱蜡：脱蜡前应将沾有组织的载玻片在室温中放置60min，或60℃恒温箱中烘烤20min，后用二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ浸泡，共25min；

（2）水化：脱蜡后的载玻片在无水酒精Ⅰ、无水酒精Ⅱ各水化2min，下行至95%酒精、80%酒精、70%酒精Ⅰ和70%酒精Ⅱ各水化2min；

（3）水化后的载玻片用PBS冲洗2-3次，每次5min；

（4）阻断：3%H₂O₂去离子水或80%甲醇孵育冲洗后的载玻片10min，以灭活内源性过氧化物酶活性；

（5）PBS冲洗2-3次，每次5min；

（6）抗原修复：载玻片置PH 6.0、温度为95℃的抗原修复液中修复15-20min，自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温；

（7）PBS冲洗2-3次，每次5min；

（8）封闭：向载玻片上组织滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体；

（9）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜后在37℃复温45min；

（10）PBS冲洗2-3次，每次5min；

（11）滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h；

（12）PBS冲洗2-3次，每次5min；

（13）滴加SP即链霉亲和素-过氧化物酶，室温或37℃孵育30min-1h；

（14）PBS冲洗2-3次，每次5min；

（15）显色：DAB显色剂5-10min，在显微镜下掌握染色程度，胞浆呈棕色者判定为阳性细胞；

（16）自来水冲洗10分钟终止反应；

（17）复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化；

（18）自来水冲洗10-15min；

（19）常规脱水、透明、封固液封片和镜检，其中封片方式为用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上。

3.根据权利要求2所述检测雌激素受体对阴茎血管内皮细胞保护作用的方法，其特征在于：所述PBS为pH7.4 、0.01M的磷酸盐缓冲液，由NaCl 8g，KCl 0.2g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.63g或Na₂HPO₄ 1.44g， 以及KH₂PO₄ 0.24g，溶于900ml双蒸水中，用盐酸调pH值至7.4，加水定容至1L配制而成。