[发明专利]一种2, 3-丁二醇高产菌株及其筛选方法和发酵方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及2, 3-丁二醇生产菌株，尤其是一种2, 3-丁二醇高产菌株及其筛选方法和发酵方法。

背景技术

2, 3-丁二醇（2, 3- butanediol，2, 3-BD），又称二甲基甲醇，2, 3-丁二醇是一种无色无味的液体，吸水性很强，熔点是23-27°C，沸点是178-182°C，冰点-60°C，能与水混溶，溶于乙醇、乙醚。

2, 3-丁二醇可以作为重要的化工原料和药物中间体。有较低的凝固点可以作为防冻剂，2, 3-丁二醇及其衍生品可以用做塑料、溶剂和药物载体；脱氢可形成双乙酰和乙偶姻，它们在日常生活中作为增味剂、人造奶油和化妆品。

化学合成2, 3-丁二醇是以石油裂解时产生的四碳碳氢化合物为原料，通过高温高压水解获得，但此方法不易操作，并且由于石油资源的短缺和石油化学产品价格的增长，很难实现工业化生产，微生物生产2, 3-丁二醇克服了化学法的困难，受到人们的关注。

2, 3-丁二醇是微生物混合酸代谢途径的代谢产物，产生2, 3-丁二醇的微生物主要有肺炎克雷伯氏菌、土生克雷伯氏菌、产气肠杆菌、多粘芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和粘质沙雷氏菌等。在这些微生物中，粘质沙雷氏菌是革兰氏阴性菌并且在环境中存在较广。粘质沙雷氏菌能在5-40°C和pH 5-9的环境下生长，另外，粘质沙雷氏菌的能利用的底物范围较广，它经常被用作生产2, 3-丁二醇的研究，具有较好的应用前景。

在大多数微生物代谢过程中，乙偶姻是2, 3-丁二醇代谢的副产物，并且2, 3-丁二醇是乙偶姻代谢的终产物。因此，先通过丙酮酸钠固体平板法、MR-VP实验初筛生产乙偶姻的微生物，再利用气相色谱检测微生物生产2, 3-丁二醇的产量。

通过检索，发现与专利申请相关的如下几篇专利公开文献：

1、一株短小芽孢杆菌及其在生产2, 3-丁二醇中的应用（CN102041240A），公开了一株产2, 3-丁二醇的短小芽孢杆菌，其中所述短小芽孢杆菌定名为短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) SDM，该菌已于2010年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC No. M2010307。本发明所述菌株能以可再生资源为碳源，通过溶解氧分段控制策略，得到2, 3-丁二醇的浓度达到70 g/L，生产强度为1.46 g/L.h。且所述菌株具有生物安全性，发酵生产的2, 3-丁二醇具有广泛的用途。  

2、利用秸秆生产2, 3-丁二醇菌种筛选及发酵方法（CN101967457A），本发明首先提供从活性污泥中筛选产2, 3-丁二醇同时能分泌纤维素酶菌株的方法，经过筛选得到产2, 3-丁二醇同时能分泌纤维素酶菌株的菌株YB-4，2010年7月14日保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.4005。同时提供了利用该菌株发酵秸秆生产2, 3-丁二醇的方法：该菌株在以汽爆秸杆为碳源，酵母膏为氮源的发酵培养基中30-37℃培养4-7d后，2, 3-丁二醇的产量为秸秆干重的8％-12％(2, 3-丁二醇/秸秆干重，W/W)。本发明为以秸秆原料生产2, 3-丁二醇，不需要添加纤维素酶，大幅度降低了生产成本。 

3、肺炎克雷伯氏菌及其制备氢气和2, 3-丁二醇的方法（CN101531979），涉及肺炎克雷伯氏菌及其制备氢气和2, 3-丁二醇的方法，肺炎克雷伯氏菌为Klebsiella pneumoniae ECU-21，保藏编号为CGMCC No.2850，其制备方法为：从平板上取一环菌落接入种子培养基，接种后的种子培养基置于 37℃培养箱中静置培养，后将培养12小时后的种子培养基转接至发酵培养基进行发酵培养；接种后用橡胶塞密封发酵摇瓶，并通入N₂吹扫使之形成厌氧培养环境，多余气体由排气口排出，气体排净后用气袋连接排气口收集发酵产生的氢气，液相产物中得到2, 3-丁二醇；培养温度为37℃，采用磁力搅拌器进行搅拌，转速为150 rpm，培养时间为12～15h。本发明的优点：在厌氧的条件下发酵联产氢气和2, 3-丁二醇，增加了生产的附加值，且反应条件简单易行，具有广阔的工业应用开发前景。 　

通过对比，本发明专利申请与上述几篇专利公开文献存在本质的不同。

发明内容