[发明专利]在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法

权利要求书

1.在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法，其特征在于：该方法包括：①透射叶片样品前处理；②制作定位专用整体断面切片、观察照相；③制作横向切片；④横向切片垂直空间和组织结构定位；⑤检验横向切片、观察、照相；⑥保障整个系统的空间定位规范；⑦根据有序的定位层面构建微观立体结构；⑧扫描电镜样品制备、观察照相、检验立体结构八个部分；

在步骤①中，取相邻两块样品垂直包埋，分别作断面切片和横向切片的包埋块；作断面切片的样品块、在60℃聚合时、时间减半，刀刃沿叶片上下表面延长线的方向、作断面切片，能获取叶片完整断面结构图；

在步骤②中：取断面定位专用样品包埋块，调整刀刃与断面上的双表皮延长线成为垂直方向，按厚度200nm作断面切片，每修掉样品约0.1mm厚，捞片，共取10个载网；采用常规醋酸双氧铀—柠檬酸铅双重染色；观察时增加加速高电到100万伏、光斑选1档，聚光镜光阑选1档；选择含上、下表皮，含维管束完整结构，照相；

在步骤③中，在切片机实体显微镜下，会观察到叶片表面是凸凹形成的条状，调整刀刃运动方向与条状结构延长线方向一致；切片面会含并行的三条以上结构，用两侧条状结构上部最高凸起处对刀，使刀刃的全部行程与叶片表面整体平行；去掉上表皮表面凸起部分，约表面积的3/4区域；开始正式切片、捞片，每去掉50片，用一个有标记的载网捞取10片，每个载网作一个计数，全叶片由上至下总计数为１—Ｎ；调整切片机按70nm进刀量切片；

在步骤④中：在步骤③中获取载网的计数１—N，在步骤②中获取的定位专用叶片整体断面图，由上至下显示叶片各层组织结构，将图在垂直方向作N等份，每份与1-N序列号的横向切片一一对应，形成玉米叶片整体结构定位图；

在步骤⑤中，作横向切片定位时，先将叶片完整断面结构图由上至下等分N份，与横向切片一一对应，将横向切片标注在相应的组织结构和垂直的立体空间上；针对不同植物选定检验切片方向精度的标准切片，禾本科植物标准横向切片的确定方法为:MX1∶MX2 ≈1；MX1：被显示出传导组织木质部或韧皮部首端的宽度；MX2: MX1所在传导组织木质部或韧皮部尾端的宽度；

在步骤⑥中，为完成最终的精准定位，在每一个步骤中含有空间定位分项操作规范，其集合保证最终结构精准定位；

在步骤⑦中，通过观察、分析可确定一些复杂的微观立体结构；

在步骤⑧中，对固定好的叶片作脱水、临界点干燥、断裂、铂金镀膜常规处理，采用扫描电镜二次电子图像，观察叶片断面及特定部位的立体结构，检验定位观察结论。

2.根据权利要求1所述的在植物叶片微观结构中定位观察而对叶片进行处理的方法，其特征在于：在步骤⑥中的具体操作为：

①前处理选择相邻的两块样品，垂直包埋，可最大程度消除结构之间的误差；

②横向切片时，先去掉上表面凸出的高度，保留凹处的1/4的面积位；在对定位专用断面组织结构分区时，去掉凸出部分从表皮最低点向上1/4高开始划分；

③采用等分断面结构图与横向切片对应的方法，抵消断面切片伸缩对高度变化的影响；这种做法基准点在中心，最大限度减少了横向切片与断面切片在操作过程中出现的误差；

④采用有标记的载网获取立体空间定位和平面空间定位，采用切片面为梯形和载网上特定标记作辅助定位等方法来作切片内结构的定位；

⑤切片时采用压片捞片法，观察时确定载片面、面向电子束，定位样品朝向。