[发明专利]介导膜稳定CD40L基因的衣壳蛋白突变的双链重组腺相关病毒制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体涉及介导膜稳定CD40L-M基因的衣壳蛋白突变的双链重组腺相关病毒载体及其制备方法与应用。 

背景技术

肺癌是中国乃至世界死亡率最高的恶性肿瘤之一。尽管近年来肺癌的早期诊断及综合治疗取得了一定的进步，但仍有90％的肺癌在发现时已发生转移，其5年生存率不足15％。因此，迫切需要寻找治疗肺癌原发灶及其转移灶的新途径。 

目前，免疫基因治疗被视为最有前景的肿瘤治疗方式之一。肿瘤免疫涉及全身免疫和局部免疫，包含着复杂的过程。肿瘤微环境（microenvironment）是肿瘤细胞和宿主免疫系统的“战场（battlefield）”，研究证实它对发挥宿主抗肿瘤免疫起着关键性作用。肿瘤细胞为了逃避宿主的免疫攻击，在微环境中运用各种方法去减弱或反击宿主的免疫系统，诸如：下调人类白细胞抗原Ⅰ类分子（HLA-Ⅰ）和肿瘤抗原，分泌免疫抑制因子，减弱共刺激信号等，从而使宿主处于免疫抑制状态，阻碍了肿瘤疫苗的系统治疗效果。因此，改变肿瘤微环境的免疫抑制（immune-compromised）状态为免疫激活（immune-competent）状态是成功进行肿瘤免疫基因治疗的关键。 

研究表明，协同刺激因子CD40L的表达缺失及CD40的持续表达可能与肿瘤的发生以及肿瘤的免疫逃逸、肿瘤微环境的免疫抑制状态相关。CD40L也称gp39、肿瘤坏死因子相关激活蛋白(TNF associated activation protein，TRAP)、T细胞-B细胞活化分子(T cell-B cell-activating molecule，T-BAM)，为33kD的II型跨膜糖蛋白，共266aa，是目前免疫基因治疗研究的热点之一。研究发现，CD40/CD40L间相互反应可阻断肿瘤细胞的细胞周期，诱导细胞凋亡，提高肿瘤细胞对其他凋亡诱导剂（如顺铂、TNF-α）的敏感性。CD40L能够上调肿瘤内源的多肽及共刺激分子的表达，增强CD40+肿瘤细胞对内源性抗原的呈递作用，使某些肿瘤细胞分泌更多的具有免疫刺激作用的细胞因子；可增强树突状细胞（Dendritic Cell，DC）、单核细胞、B细胞等抗原呈递细胞CD54、CD80、CD86、ICAM-I、LFA-4等协同分子的表达，促进其与T细胞间的相互作用，增强T细胞的活化与增殖；还可抑制IL-10和TGF-β的产生，诱导肿瘤部位的Th1反应，进而抑制肿瘤的发生。CD40L与CD40的结合能诱导各种细胞因子和化学因子 的产生，如IL-6、IL-8、IL-12、TNF-α、INF-γ等；还可通过诱导产生的IL-12上调T细胞表面CD40L的表达，与其它共刺激分子（如B7-1、B7-2）协同作用，促使CD40L的表达量提高。DC是激发B和T淋巴细胞介导免疫反应的重要的高效专职抗原提呈细胞；CD40L通过活化DC上调上皮癌细胞共刺激分子的表达和细胞因子的产生而增加肿瘤的免疫原性；通过刺激DC的CD83等共刺激分子的表达，加速DC表型的成熟；通过诱导外周血单个核细胞，使其分化为表达CD1a、CD80、CD83、HLA-DR的DC。同时，CD40L还直接作用于T细胞，通过Flt3与CD40L的共同反应产生更强的抗肿瘤反应；CD40L激活DC后，又进一步提高DC与T细胞及肿瘤细胞间的相互反应和免疫效应功能。因此，CD40L和CD40的相互作用对于机体抗原提呈细胞的活化、体液免疫和细胞免疫应答的启动、免疫应答效率的提高起着重要作用，这在调节肿瘤微环境，诱导抗肿瘤免疫及抑制肿瘤生长中具有非常关键的地位（Loskog AS，Eliopoulos AG：The Janusfaces of CD40 in cancer.Semin Immunol 2009；21：301-7.)。目前，CD40L相关的治疗在B细胞恶性肿瘤、多种实体瘤及肿瘤转移灶的前临床试验中均取得了令人鼓舞的疗效。而CD40L相关的治疗方法，包括联合传统的（如：5-FU）或新颖的（如：溶瘤病毒）方法，也在前临床试验中展示出很好的疗效。CD40L已成为肿瘤免疫基因治疗的最佳目的基因之一。