[发明专利]一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物化学领域，特别涉及一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽，还涉及该多肽在制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体中的应用。

背景技术

乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE，EC3.1.1.7)是生物神经传导中的一种关键酶，是主要的信号传递分子，主要存在于多细胞动物的神经元间、神经元与肌肉细胞间的化学突触上，为膜结合蛋白，定位于细胞膜和突触前后膜，能快速水解神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine，ACh)从而终止ACh对胆碱能受体的兴奋作用，保持神经冲动传导的灵敏性。乙酰胆碱酯酶是生物体内反应最快的酶之一，降解一个分子约80微秒。

由于在周围神经中，运动神经束和感觉神经束乙酰胆碱酯酶的含量相差数十倍，定量分析手术断端神经束的乙酰胆碱酯酶含量能够在临床上快速、准确地分辨感觉神经和运动神经，在临床上有巨大的应用潜力。

现有乙酰胆碱酯酶的含量通常采用技术成熟稳定的压电免疫传感器测定，该方法快速、准确，具有在线分析的功能。压电免疫传感器的检测区间主要取决于检测乙酰胆碱酯酶的芯片，而该芯片的检测区间主要取决于其中所用的单克隆抗体的亲和性和效价。现有市售的抗体制备的抗体芯片，其检测浓度值的线性区间在0.5-2μg/ml，和夹心ELISA检测区间相似。然而，由于手术切除标本断面较小，溶解于细胞裂解液中的蛋白含量较低，其中含有的乙酰胆碱酯酶在夹心ELISA检测的线性范围之外（小于1ng/ml）。因此，将免疫压电传感器检测乙酰胆碱酯酶的含量的方法应用于临床，迫切需要制备更高亲和性和高效价的单克隆抗体。

现有用于压电免疫传感器的单克隆抗体，主要选取乙酰胆碱酯酶抗原蛋白质内免疫原性较高的多肽，藕联大分子（如BSA、BTG）为抗原，免疫后用多肽氨基酸序列相同而藕联的大分子不同的抗原筛选出单克隆抗体；然而，免疫原性较高的多肽往往处于抗原蛋白质的疏水端，导致现有乙酰胆碱酯酶抗体的亲和性和效价较低。

发明内容

本发明的目的是提供一种亲和性高、效价高的多肽即其制备方法。

在本发明的第一方面，提供一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽，包含SEQ ID No：1或2所示的氨基酸序列，所述SEQ ID No：1的氨基酸序列为NH2-GDPNEPRDPKAPQWPPYTAGGC-COOH，所述SEQ ID No：2的氨基酸序列为NH2-CGGPRRFLPPEPKQPWSGVVD-COOH。该多肽可特异性的与乙酰胆碱酯酶抗体结合。

在本发明的第二方面，提供了一种多肽偶联物，所述多肽偶联物由多肽、交联剂和大分子物质构成，其中所述多肽包含SEQ ID No：1或2所示的氨基酸序列，所述交联剂为甲醛和乙酸钠的混合物，所述大分子为牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、钥孔虫戚血蓝蛋白（LKH）或甲状腺球蛋白（BTG）。

在本发明的第三方面，提供了一种用于制备检测乙酰胆碱酯酶的抗体，所述抗体特异性地与权利要求1所述的多肽结合。

作为优选，本发明的第三方面所述抗体为单克隆抗体。

在本发明的第四方面，提供了上述多肽在制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体中的应用。

所述应用，包括以下步骤：

（1）将包含SEQ ID No：1或2所示的氨基酸序列的多肽偶联大分子获得全抗原；

（2）将所述全抗原通过免疫制得用于检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体；

（3）将所述单克隆抗体应用于压电免疫传感器检测乙酰胆碱酯酶。

有益效果：本发明提供的用于制备检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体的多肽亲和性高、效价高，利用该多肽制备得到的单克隆抗体应用于压电免疫传感器，对乙酰胆碱酯酶的检测灵敏度高、准确率高。

本发明通过对乙酰胆碱酯酶的蛋白质结构中每个氨基酸的亲水性、抗原性分析，找寻和设计了2个亲水性和抗原性较高氨基酸序列；再将这两个亲水性和抗原性较高的氨基酸序列偶联大分子获得全抗原，通过免疫制得用于检测乙酰胆碱酯酶的单克隆抗体，制得的单克隆抗体亲和性高、效价高。并将该单克隆抗体应用于检测乙酰胆碱酯酶的压电免疫传感器，可显著提高检测灵敏度与准确率。

附图说明

图1为实施例3制得的鼠单抗在人白血病细胞中AChE的免疫共沉淀图。

图2为实施例3制得的鼠单抗在鼠脑组织中AChE的免疫共沉淀图。

图3为鼠脑组织AChE单抗免疫组化图。

图4为人脊髓前根AChE单抗免疫组化图。