[发明专利]一种产生胶原蛋白酶的菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株产生胶原蛋白酶的菌株的分离、筛选，鉴定和其在降解胶原蛋白中的应用以及利用该菌生产胶原蛋白酶的方法。

背景技术

胶原蛋白是一种白色、不透明、无支链的天然的纤维蛋白质，它广泛存在于动物的皮肤、骨骼、牙齿、肌腱韧带和血管中，是哺乳动物体内含量最丰富的蛋白质之一。其主要功能是维持皮肤和组织器官的形态和结构，起到支撑器官和保护机体的功能。

由于胶原蛋白具有独特的三股超螺旋结构，性质十分稳定，一般的加工温度及短时间加热都不能使其分解，从而造成其消化吸收困难，不易被人体充分利用。而将胶原蛋白水解为胶原短肽，则其在消化吸收、营养、功能特性等方面都会得到显著地提高。公开文献（唐传核等.胶原的开发及利用.肉类研究，2000，3：41～44）已报道，将胶原蛋白水解成寡肽产物，可以在不破坏其营养价值的情况下获得如下功能性：胶原蛋白短肽具有易消化吸收、保护胃黏膜及抗溃疡、抗过敏、降血压、抗菌、抗氧化、降胆固醇、抗衰老、促进伤口愈合、增强骨强度和预防骨质疏松、预防关节炎、促进角膜上皮损伤的修复和促进角膜上皮的生长等多种生理活性。另外，通过水解将大分子的胶原蛋白转化成主要含有小分子肽和氨基酸的水解物，可以改善胶原蛋白的水溶性，方便加工，有利于开拓其食品用途。如鱼皮胶原为原料制备出类此水解物，则可以为鱼皮的合理利用开辟新途径。

目前，将食品蛋白质水解为肽的方法主要有酸、碱解法和酶解法。其中酶水解法，水解条件温和，氨基酸不被破坏等优点，目前在广泛应用。酶水解食品蛋白的具体方法,如专利：JP8027035A；CN1344138A等。现在制备胶原蛋白短肽的酶均为市售的普通蛋白酶。酶源单一，成本较高等特点影响了胶原蛋白及相关产品的开发和利用。筛选新的胶原蛋白酶产生菌，优化胶原蛋白酶产生菌的培养条件，分离胶原蛋白酶等的研究对丰富和利用胶原蛋白酶及胶原蛋白的开发利用有深远意义。海参体壁主要成分是胶原蛋白，海参肠道自溶酶对其体壁蛋白质水解活性十分高，而且其自溶酶主要来自于自身肠道菌。海参肠道菌群是筛选产胶原蛋白酶菌的很好的原料。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株产胶原蛋白酶的菌株及其筛选方法。

本发明所提供的嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila）DLW-22是从海参肠道菌群中分离、筛选得到的，已于2012年8月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称：CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101），保藏号为CGMCCNo.6488，属于沙雷氏菌属（Serratia）。

本发明的嗜虫沙雷氏菌（Serratia entomophila）DLW-22用如下方法分离、筛选得到：

①海参肠道混合菌液的制备：用无菌水将海参活体洗净，取部分肠段或全肠，混合于无菌水中，震荡，离心后吸取上清液，接种于5～15倍体积的基础培养基中富集培养，在25～45℃，摇瓶培养24～48h，获得海参肠道菌混合液；

其中所述基础培养基：每升蒸馏水中含有酵母膏5g，NaCl 10g,蛋白胨10g,pH为自然；

②初筛：将步骤(1)制备的海参肠道菌混合液，梯度稀释后涂布于初筛培养基平板上，25～45℃倒置培养至形成单菌落，观察并选取具有透明圈的单菌落，转至另一初筛平板上，30～40℃培养24～48h，在菌落周围滴加酸性汞试剂，观察透明圈形成情况；

其中所述的初筛培养基：每升蒸馏水中明胶20g，葡萄糖30g,蛋白胨5g，KH₂PO₄ 0.5g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，NaCl 0.1g，pH为自然；所述的酸性汞试剂：HgCl₂ 15g，浓盐酸20g，溶于蒸馏水，定容至100mL；

③复筛：挑取滴加酸性汞试剂时有明显透明圈的菌落，接种于种子培养基中，摇瓶培养12～24h；接种至发酵培养基中，25～45℃摇瓶培养24～48h，得到菌培养液；