[发明专利]利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物寄生线虫的繁殖培养和保存方法，具体涉及一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法。

背景技术

对于植物寄生线虫，要研究其系统分类、分子生物学、功能基因组学以及蛋白质组学等基础研究，或者在实验室和田间进行生物学、病理学以及防治方法等基础和应用研究，都需要大量、纯化的线虫。然而，植物寄生线虫大多都是专性寄生的，很难在纯培养基上培养，只能在相应的寄生植物上繁殖。在实际中，人们往往利用植物组织培养技术在White（1963）、Krusberg（1961）和Gamborg’s B5等植物组织培养基或1％水琼脂培养基上，培养新鲜的植物愈伤组织、离体根或其他一些植物器官及整株植物幼苗，然后在这些植物材料上接种培养繁殖植物寄生线虫；兼食真菌的植物线虫，也可以用某些种类的真菌菌丝来培养（冯志新，2001）。不同类型线虫的培养所采用的具体方法取决于其生物学特性。

腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）、起绒草茎线虫（D.dipsaci）和香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）都是迁移性内寄生线虫，严重为害多种作物，均被我国列为检疫性植物有害生物。对腐烂茎线虫和起绒草茎线虫，目前可利用在培养基上培养的紫花苜蓿愈伤组织或真菌进行人工培养繁殖；对香蕉穿孔线虫，则利用在培养基上培养的紫花苜蓿愈伤组织和胡萝卜愈伤组织或利用无培养基的胡萝卜片长出的愈伤组织，进行人工培养繁殖。但是利用培养基培养植物愈伤组织或真菌，再接种培养繁殖线虫，操作复杂，同时易发生污染导致繁殖成功率和繁殖量低，直接用无培养基的胡萝卜片长出的愈伤组织繁殖和培养保存香蕉穿孔线虫的方法，也因胡萝卜含水量大、易带内生细菌发生腐烂，存在不能长期培养保存等缺陷。

发明内容

为克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法。该方法可实现即简单、大量人工培养繁殖线虫，又长期保存线虫资源的目的。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种利用甘薯愈伤组织繁殖培养和保存植物寄生线虫的方法，包含以下步骤：

（1）甘薯愈伤组织的制备：将新鲜健康的甘薯洗净晾干，用酒精浸泡后，灼烧，至表皮变暗，削去表皮，切成甘薯片，放入灭菌培养皿中，封口，于22～28℃暗培养至长出甘薯愈伤组织；

（2）植物寄生线虫的消毒和接种：挑取或吸取植物寄生线虫，消毒，然后离心，去除上清，将沉淀的线虫用无菌水混匀继续离心，去除上清，最后将沉淀的线虫用无菌水稀释分散滴在甘薯愈伤组织上，封口；

（3）植物寄生线虫的繁殖培养：将步骤（2）中接种了植物寄生线虫的甘薯愈伤组织进行暗培养繁殖，培养温度为植物寄生线虫繁殖的适宜温度；

（4）植物寄生线虫的保存：将植物寄生线虫连同甘薯愈伤组织于4～20℃保存；

步骤（1）中所述的酒精选用工业酒精即可，其浓度优选为质量百分比70%；

步骤（1）中所述的浸泡的时间优选为2min；

步骤（1）中所述的甘薯片的厚度根据培养皿的厚度，以距离皿盖至少5mm为宜，优选厚度为4mm，太厚靠近皿盖，不易于接种，太薄容易缺失水份，薯块易干，不易于长期培养、繁殖率低；

步骤（1）中所述的培养皿可以是多种规格，优选直径为6cm的培养皿；培养皿大太占用空间，太小则只放较小的薯块，不利于提高线虫的繁殖率，此外，6cm的培养皿便于保存；

步骤（1）中所述的封口可用封口膜或者保鲜膜进行封口；

步骤（1）中所述的暗培养的温度更优选为25℃；

步骤（1）中所述的于22～28℃暗培养至长出甘薯愈伤组织的时间一般为10～15天；

步骤（2）中所述的植物寄生线虫优选为腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）、起绒草茎线虫（D.dipsaci）或香蕉穿孔线虫（Radopholus similis）；

步骤（2）中所述的消毒优选为使用质量百分比0.2%的硫酸链霉素溶液处理3～12h，可以达到消毒目的，不影响其正常的繁殖发育；

步骤（2）中所述的离心的条件优选为4000rpm离心2min；

步骤（3）中所述的培养温度要根据被培养繁殖的植物线虫种类的生物学特性确定；因为植物寄生线虫不同属、种间的生物学特性存在差异，最合适的生长温度有所不同；

当所述的植物寄生线虫为腐烂茎线虫时，所述的培养温度为20～25℃；

当所述的植物寄生线虫为起绒草茎线虫时，所述的培养温度为17～20℃；