[发明专利]一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法

说明书

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断应用研究领域中的通过毛细管电泳检测基因突变实现肿瘤早期诊断的研究领域，尤其涉及一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法。

背景技术

目前，随着外界环境的变化和人类饮食习惯的改变，消化道肿瘤作为我国最常见的恶性肿瘤之一, 其发病率逐年提高，发病年龄也趋于年轻化，严重威胁着人们的健康与生命。虽然传统的消化道肿瘤诊断方法例如X 光、B 超、CT、核磁共振、内窥镜等的影像学及染色体检查等在普通临床诊断中发挥了巨大作用，但是对于消化道肿瘤的早期诊断具有无法逾越的鸿沟——预警，往往等确诊消化道肿瘤时已错过最佳治疗时间，大大降低了术后存活率。消化道肿瘤和其它肿瘤发生机理一样，都是一个多因素、多基因、多步骤的癌变过程，涉及大量相关基因结构和表达调控的改变，尤其是癌基因的活化和抑癌基因的失活起着重要作用。其中，p53、APC、C-myc和K-ras基因突变与消化道肿瘤发生息息相关。打破传统，从肿瘤标记物入手，寻找并建立准确、快速的用于肿瘤临床早期诊断的方法势在必行。外周静脉血液具有容易采集及携带大量遗传信息等优点是作为早期诊断较为合适的检测对象。采用毛细管电泳技术结合单链构象多态分析方法检测外周静脉血液中消化道肿瘤发生发展相关基因来实现消化道肿瘤早期诊断是有据可依的。

毛细管电泳(CE)是一种新型电泳与色谱相结合的分离分析技术，具有分离效率高、分析速度快、样品用量少、应用范围广等特点。近年来，CE与各种基因突变检测技术例如SSCP（单链构象多态性检测）、RFLP（限制性内切酶片段长度多态性）相结合时，在突变基因检测方面显示了无可比拟的优越性。在1984~2010年中国专利数据库中记载了申请号为03824891.3 的中国专利《 诊断结肠癌和消化道肿瘤的方法》、申请号为200510049824.9的中国专利《一种从血清中早期检测消化道肿瘤的方法》、申请号为 200610088963.7的中国专利《一种用于消化道肿瘤诊断的药物及其制备方法》、申请号为 200610030119.9的中国专利《消化道肿瘤辅助诊断的基因序列及其应用》申请号为 200810043822.2的中国专利《一种消化道肿瘤诊断方法》、申请号为 03108102.9的中国专利《一种消化道肿瘤荧光诊断试剂》、申请号为 98803363.1的中国专利《早期消化道肿瘤的诊断》，上述专利仅仅公开了采用质谱检测血清中蛋白质组成的指纹图谱，采集生物学信息进行分析、采用基因序列和基因芯片试剂盒，辅助诊断消化道肿瘤、采用抗原抗体特异结合后，采用核医学影像技术对肿瘤定位、采用荧光诊断试剂配合胃镜及病理切片诊断消化道肿瘤、通过检测尿液中目标分子蛋白含量等技术进行消化道肿瘤临床诊断。上述方法仍然无法打破早期诊断的瓶颈。而通过采用毛细管电泳结合SSCP、RFLP用于检测血液中相关特异基因突变而实现消化道肿瘤临床早期诊断却未见文献报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、易行，达到预警目的的用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法。

为解决上述问题，本发明所述的一种用于消化道肿瘤临床早期诊断的辅助方法，包括以下步骤：

⑴毛细管柱内壁修饰：将内径为50~75um的毛细管内壁用0.15~0.2mol/L NaOH清洗后，依次将γ-甲基丙烯酰基-三（甲氧基）硅烷/甲醇溶液和质量浓度为3.4%丙烯酰胺单体溶液充填入毛细管柱内进行共价涂层修饰；

⑵含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2.5~3.5%、pH值为7.5~9.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.22~0.45um水系微孔滤膜过滤后，所得滤液即为聚环氧乙烷筛分介质；

⑶血液样品收集：分别收集临床消化道肿瘤患者及正常健康体检患者外周静脉血液样品2~3ml，该收集血液样品全部采用pH值为8.0且2 mmol/L的EDTA抗凝，-80℃分装保存；

⑷血液样品中基因组DNA提取：在所述步骤⑶中所得的血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55~57℃水浴孵育2~6h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥，即得基因组DNA；