[发明专利]一种基于简易大规模PCR高效制备线性DNA的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种大规模PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）低成本、高速率制备线性DNA的方法，属于工业微生物应用领域。

背景技术

PCR（polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）是Kary B. Mullis（Nobel Laureate for procedure to replicate DNA，science，1985）首次发明的体外扩增线性DNA的技术，是现代分子生物学最重要的基本研究手段之一。

PCR模拟于DNA的自然复制过程，它利用人工合成引物介导的DNA聚合酶促反应，引物按照碱基配对与DNA模板互补结合以后，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基配对的原则从引物开始合成与模板DNA互补的DNA链。经变性、退火、延伸等一次循环，DNA链的数量增加一倍，模板在以后进行的循环，新合成的DNA可再次成为模板。如此循环一次，DNA拷贝数便增加一倍。经多次循环，可以将目的DNA的量扩增10⁶-10⁷倍。PCR技术因其具有操作简单、快速、特异性好、灵敏度高等特点而广泛应用于分子生物学、免疫学、医学等领域。最近的研究表明，PCR方法不仅是一种分子生物学的研究手段，而且在生产实际中的应用越来越广泛，如利用PCR方法获得线性DNA疫苗的研究方法随着部分DNA疫苗的上市越来越受到研究者的亲睐。

随着研究的深入，PCR技术日趋完善，但若将传统的PCR方法应用于生产实际仍存在着极大的局限性，如生产成本高和生产规模小等问题，具体可归纳为：(1) 一般情况下，常规PCR扩增都是基于造价昂贵PCR仪和售价高的DNA聚合酶，因此，若通过常规PCR模式在短时间内获得大量的PCR产物，成本极高；（2）目前的常规PCR仪有以下几种规格：a、0.2mL×25孔，b、0.2mL×96孔，c、0.2mL×384孔，d、0.5 mL×20孔，e、0.5mL×60孔。其中单次PCR产量最大的仪器是0.2mL×384孔，在不计损耗的情况下进行一次PCR最多只可得到76.8mL产物。因此，若需要获得大量的PCR产物，需要将样品分装，逐个收集并纯化，操作繁琐且容易污染；（3）若制备大量线性DNA，需要进行反复多次PCR操作才能获得，周期长、效率低。

目前，鉴于DNA疫苗的相继上市以及线性DNA疫苗受到研究者亲睐的原因，世界科研机构和疫苗生产公司也相继把目光集中在线性DNA的生产方法上。但是，他们仍然主要采用传统的PCR方式生产线性DNA，如Vandalia公司研发出的一种大体系PCR平台可以达到每天12L的产量，但由于生产成本高和生产速率慢等原因仍然无法实现工业化生产的需要。

为此，本发明在低成本获得性能优异的DNA聚合酶（专利名称：一种利用毕赤酵母高效表达DNA聚合酶的方法，专利号：ZL201010229160.5)的基础上，建立了一种大规模PCR低成本、高效生产线性DNA的方法，为解决线性DNA疫苗工业生产的瓶颈问题奠定基础。

发明内容

本发明的目的是为了改进上述常规PCR仪器设备和DNA聚合酶费用高、获得线性DNA产量少、效率低等缺点，提供了一种大规模PCR技术高效、低成本大量制备线性DNA的方法，拟为进一步利用该方法高效快速制备线性DNA疫苗应对新发传染病奠定基础。

本发明中大规模简易PCR制备大量的线性DNA的具体方法，包括以下步骤：

1）制备种子DNA聚合酶，简称RKOD

用专利（ZL201010229160.5)制备菌株，接种于50mLBMGY培养基中，以150-250r/min 的转速在25℃-30℃培养40-50小时，至OD₆₀₀为6-10，于室温3000-6000r/min离心5min，收集菌体。将菌体转移至25mLBMMY培养基中，以150-250r/min 的转速在25℃-30℃培养，每隔24小时补加一次甲醇（每次加培养基体积的0.5%），72小时收集上清，即为下步所需的DNA聚合酶；该聚合酶具有5’→3’和3’→5’核酸外切酶活性，其错配率为1.1×10^-6，具有每分钟延伸3kbp、耐高温特性；

所述的LBMMY培养基配方：2%Tryptone，1%Yeast Extract，0.34%YNB，1%（NH₄）₂SO₄，100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH6.0，1%甘油；

2）设计正反引物