[发明专利]一种嗜热链球菌噬菌体抗性突变体筛选方法

说明书

技术领域

本发明涉及发酵乳制品工业中的嗜热链球菌遗传育种技术，尤其涉及一种嗜热链球菌噬菌体抗性突变体筛选方法。

背景技术

嗜热链球菌是酸奶、奶酪生产的主要发酵菌种之一，其在发酵前期快速发酵产酸抑制杂菌污染、产胞外多糖改善酸奶质构等方面有着重要作用。但由于嗜热链球菌多为烈性噬菌体，与乳杆菌相比更容易受噬菌体侵染。噬菌体发生侵染后可造成嗜热链球菌细胞裂解，导致发酵缓慢、酸奶产品口感风味变差[马成杰等，嗜热链球菌噬菌体对酸奶质量的影响，食品科学，2009，30（21）7：328-331]，成为限制发酵乳制品行业发展的世界性技术难题，因而乳酸菌抗噬菌体菌株的选育与研究备受国内外关注。

在中国，酸奶是最主要的发酵乳制品，2011年产量已达200万吨。针对嗜热链球菌的噬菌体污染问题，国内外开展了一些噬菌体抗性菌株的筛选工作，主要是在自发突变或物理、化学诱变条件下，用双层琼脂平板法、次级生长法筛选嗜热链球菌噬菌体抗性菌株[Binetti A G, et al. Spontaneous phage-resistant mutants of Streptococcus thermophilus: isolation and technological characteristics. International Dairy Journal, 2007, 17(4): 343-349]。如冷一非等以酸奶生产菌株嗜热链球菌S2为出发菌株，采用双层琼脂平板、自然选育的方法筛选出了4株抗噬菌体的非溶源性突变株[冷一非等，嗜热链球菌抗噬菌体菌株的选育，中国酿造，2010，7，118-120]。李亚蕾等用平板法，通过自发突变、紫外诱变、硫酸二乙酯诱变进行了抗噬菌体的嗜热链球菌筛选[李亚蕾等，抗噬菌体嗜热链球菌突变菌株Streptococcus thermophilus-21UD的选育，食品工业科技，2008，29（11），118-121]。但由于微生物自发突变概率极低（一般只有10^-8～10^-9），而发生在噬菌体抗性方面的定向突变概率则更低。而传统的双层平板法、次级生长法取0.1～1.0mL敏感菌株发酵菌液（菌数含量10⁷～10⁸ cfu/mL）涂平板，敏感菌株细胞数量不到10⁸，假设噬菌体抗性定向突变概率为10^-10，则理论上至少要涂布100个平板才能得到1个噬菌体抗性突变株，一次筛选成功概率非常低。另一方面，由于只有处于感受态（一般为处于对数生长期的微生物细胞）的菌体才对噬菌体敏感，而传统方法所取的发酵菌液细胞不一定都处于感受态，故用次级生长法或双层平板法长出的菌落很多经复筛并不是真正的抗性突变体，这进一步加大了我们的筛选难度与工作量。而使用紫外、硫酸二乙酯、亚硝基胍等物理化学诱变，虽使微生物的突变概率增大，但由于这些物理化学诱变并非定向诱变、可能在外界因素诱导下在发生了噬菌体抗性突变的同时也发生了其他突变，导致噬菌体抗性突变株的产酸、产粘等生产性能下降甚至是在牛乳中不发酵产酸。

发明内容

本发明的目的是针对传统嗜热链球菌噬菌体抗性突变体（bacteriophage insensitive mutant, BIM）筛选方法工作量大、效率低、突变体菌株生产性能不佳等技术难题，提供一种嗜热链球菌噬菌体抗性突变体筛选方法。

本发明的目的是这样实现的：

通过菌体浓缩、驯化初筛和复筛验证3个步骤，实现了嗜热链球菌噬菌体抗性突变体的高效、快速筛选。

具体步骤如下：

①敏感菌株的次级培养与菌体浓缩

在一定体积的培养基中接入嗜热链球菌敏感菌株，培养至对数生长初期，按MOI≥1接入纯化的噬菌体裂解液，培养至裂解完全，继续培养进行次级生长，通过离心等方法进行未裂解菌体的浓缩与收集；

②高噬菌体浓度下的培养驯化与梯度稀释初筛

将步骤①中的浓缩菌体接入较小体积的培养基质中，并同时接入纯化的高浓度噬菌体裂解液，培养、驯化1～20次，梯度稀释后涂平板，获得单菌落，得BIMs的初筛；

③BIMs的复筛、确认

初筛得到的BIMs经浊度试验、产酸抑制试验进行复筛、抗噬菌体性能确认；

所述步骤①中的培养基指供嗜热链球菌生长、繁殖用的必需营养基质，一般都含有碳源、氮源、无机盐（包括微量元素）以及维生素和水等，其较佳地为LM17或LM17-Ca培养基；