[发明专利]用于检测弗氏枸橼酸杆菌的靶基因及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测弗氏枸橼酸杆菌的靶基因以及检测该基因的引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行弗氏枸橼酸杆菌检测的试剂盒。

背景技术

弗氏枸橼酸杆菌（Citrobacter freundii）属于枸橼酸杆菌属，肠杆菌科。革兰氏阴性杆菌，兼性厌氧，周身鞭毛，菌毛，无芽胞，无荚膜。弗氏枸橼酸杆菌广泛存在自然界，是人类和动物肠道的寄生菌。已有文献报道它可引起原发和继发的感染。弗氏枸橼酸杆菌可以在正常人和动物的粪便以及环境中分离到。然而，研究者逐渐认识到弗氏枸橼酸杆菌可以引起腹泻和其他感染如：尿道感染、脑膜炎、脓毒症以及医院获得性感染。

与其他肠道病原菌如大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌等相比，弗氏枸橼酸杆菌很少被报道引起腹泻等肠胃炎。这可能与临床样本筛查中，很少将弗氏枸橼酸杆菌作为常规筛查的菌株。但是，弗氏枸橼酸杆菌也能引起一些偶发和爆发的病例。弗氏枸橼酸杆菌也引起类似大肠杆菌引起的重症肠胃炎。Tschape等报道弗氏枸橼酸杆菌在德国的一家托儿所和幼儿园引起的暴发，造成肠胃炎152例，其中8例发展为HUS。Ibenyassine等对食品进行调查发现食品中发现弗氏枸橼酸杆菌的检出率可达18.7%，我国的多个研究中也表明食品中弗氏枸橼酸杆菌也有较高的分离率。在我国，一些食物中毒或腹泻病人的粪便标本中，不能分离到常见的致病菌，却能分离到弗氏枸橼酸杆菌。弗氏枸橼酸杆菌也可能是院内感染最重要的致病菌之一，2002年在日本名古屋的一所医院外科发生了耐三代头孢的弗氏枸橼酸杆菌感染的小型暴发。研究提示弗氏枸橼酸杆菌可能是一种尚未被人们充分认识的肠道病原菌。

在感染性腹泻病原菌检测过程中，往往忽略对弗氏枸橼酸杆菌的检测，且目前没有特异的弗氏枸橼酸杆菌的筛选培养基。弗氏枸橼酸杆菌很难和其他肠道菌区别，目前只能通过生化鉴定来进行分开。然而生物鉴定费时费力，不利于临床对病原菌快速检测的要求。

近年来，实时荧光TaqMan PCR技术（real time TaqMan PCR,TaqMan是罗氏公司的注册商标）广泛应用于多种病原微生物的检测，与普通PCR方法相比较，实时荧光TaqMan PCR技术在普通PCR的基础上加入一条特异的荧光探针，并且该技术对引物与模板的同源性要求也高于普通PCR。实时荧光TaqMan PCR中的探针序列必须与目标序列完全匹配，荧光基团连接在探针的5’末端，而淬灭剂则在3’末端。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，但在PCR扩增时，随着引物的延伸Tag酶的5’到3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光检测系统可接受到荧光信号。即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此实时荧光定量PCR方法比普通PCR法具有更高的特异性。但是在荧光TaqMan PCR技术的应用中，探针的选择是一个重要因素，因为其涉及到与引物的匹配，以及最关键的检测特异性的问题。

目前，在国内外研究中，没有对弗氏枸橼酸杆菌进行荧光定量PCR检测方法的报道。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供用于检测弗氏枸橼酸杆菌的靶基因。

本发明的第二个目的在于提供针对上述靶基因的特异性引物和探针；

本发明的第三个目的在于提供检测弗氏枸橼酸杆菌的试剂盒。

基于以上目的，本发明对弗氏枸橼酸杆菌的TTRP基因与NCBI上公布的其他细菌的核苷酸序列进行反复比对和筛选，发现弗氏枸橼酸杆菌的TTRP基因仅与沙门氏菌同源性较高，同源性达到84%，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。而且该基因在100bp-650bp之间特异性很高，具有高度的保守性，可以很好的区分弗氏枸橼酸杆菌与其相近的沙门氏菌和枸橼酸杆菌属的其他种。

本发明针对弗氏枸橼酸杆菌的一个三羧酸循环调控基因(简称TTRP)特有序列设计引物和TaqMan探针，并将获得的特异性引物和探针在NCBI数据库进行比对，以排除引物-探针与其他物种序列可能存在的非特异性匹配，最终获得优化后的引物、探针序列。

进一步，本发明提供用于特异性扩增上述靶基因序列或其特异片段的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。其中探针的5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ1。上游引物选自于TTRP基因的第211到229位核苷酸。下游引物选自TTRP基因的第104到126位核苷酸。

本发明提供的优选的引物序列为：

上游引物：GCAGGACAGGAAGCGTCTG，