[发明专利]自主复制型表达载体pEV及其制备方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及自主复制型表达载体pEV及其制备方法与应用，特别是一种适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV及其制备方法与应用，属于海洋生物技术技术领域。

背景技术

在生物技术与生物工程领域中，通过将外源基因克隆于表达载体上，转入到一个合适的宿主细胞中，来达到表达和制备重组蛋白的目的。将这种表达系统应用到工业生产中，可以用于大量制备重组蛋白，达到工业化水平。

地球上的低温生境非常广泛，包括深度超过1000米的海洋、极地和许多季节性的寒冷环境等等。这些低温生境中存在大量的微生物，其中大部分为适冷微生物。由于长期生活在低温环境下，适冷微生物所产生的酶类等蛋白质往往具有适冷特性，即在低温下的高催化效率和高温下的低稳定性。有研究表明，低温环境有利于适冷蛋白的重组表达，可以更有效地得到有活性的适冷蛋白。虽然大肠杆菌表达系统是目前最成熟和常用的表达系统，但大肠杆菌为中温菌，最适生长温度为37℃。在这样高的温度下，适冷酶既不稳定，也难以进行活性表达，往往以包涵体的形式存在。而降低大肠杆菌的培养温度，会降低大肠杆菌的生长速率和表达效率。因此，大肠杆菌表达系统并不是适冷蛋白重组表达的最佳选择。由于适冷细菌能在低温下快速生长，所以建立适冷细菌为宿主的表达系统可以对适冷蛋白进行有效的活性重组表达。近些年，国外虽已有开发出适冷细菌表达系统的报道，但仍然没有商品化的低温表达系统。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用适冷假交替单胞菌进行异源蛋白低温表达的方法。

名词解释

纤维素酶酶活单位(U)定义为35℃下每分钟释放1μg葡萄糖所需酶量。

接合转移频率定义为接合转移后每个受体菌所产生的接合转移子数目。

本发明的技术方案如下：

适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV的构建方法，步骤如下:

1）以质粒pKNG101为模板，利用EasyTaq DNA Polymerase进行PCR扩增，经回收，制得质粒pKNG101的DNA片段，PCR扩增引物序列如下：

OriT1：5’-GCCAGCTCGTCGGTGTAGCT-3’，    SEQ ID NO.3

RK2：5’-CAACAACGTTGCCCGGATCG-3’，      SEQ ID NO.4

2）将步骤1）制得的质粒pKNG101的DNA片段和载体pGEM-T Easy的混合液4μl、5μl连接缓冲液、1μl连接酶混合后，16℃连接过夜，得质粒；

3）以质粒pWD为模板，利用Pfu DNA Polymerase进行PCR扩增，PCR扩增引物序列如下：

ZF：5’-AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3’，    SEQ ID NO.5

CMR：5’-GGACTAGTGAAGCACACGGTCACACTG-3’，SEQ ID NO.6

经纯化回收后，用限制性内切酶SpeI和PstI双酶切处理，回收酶切DNA片段，然后插入到同样经限制性内切酶SpeI和PstI双酶切处理后的步骤2）制得的质粒中，制得pOriT-4CM质粒；

4）人工合成含有木聚糖酶启动子、多克隆位点和His-tag及终止密码子的DNA片段，在片段的两端引入SphI和NotI识别位点；用限制性内切酶SphI和NotI双酶切处理，经纯化回收后，插入到同样经限制性内切酶SphI和NotI双酶切处理的步骤3）制得的pOriT-4CM质粒中，制得自主复制型表达载体pEV。

所述步骤4）中含有木聚糖酶启动子、多克隆位点和His-tag的DNA片段制备步骤如下：

选取Pseudoalteromonas sp.BSi20429的木聚糖酶基因起始密码子前200bp的DNA序列其后紧跟4个限制性内切酶序列，His标签（CACCACCACCACCACCAC）和终止密码子（TAA），人工合成这段DNA片段并在片段两端引入SphI和NotI识别位点。