[发明专利]大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法

权利要求书

1.大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、大豆根表面的清理及灭菌；

二、采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA；

三、大豆根总DNA的纯化；

四、以纯化后的大豆根总DNA为模板，以799F和1492R为引物，进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A；

五、在引物968F的5’端加上40bp含GC碱基的片段，然后以产物A为模板，采用添加了GC碱基片段的引物968F和1378R为引物，进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B；

六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向DGGE胶的加样孔中加入200μL产物B，在180V电压下，电泳3h，最终确定变性剂浓度梯度为30％～70％；

七、使用变性梯度凝胶电泳装置进行水平电泳，选择变性剂浓度梯度为30％～70％，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向每个加样孔加入10μL产物B，在180V电压下，电泳6h，电泳结束后对DGGE胶进行染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法；其中步骤四中第一次PCR扩增所用引物799F序列为5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’，引物1492R  序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；步骤五中引物968F序列为5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’，引物1378R序列为5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’，引物968F的5’端加上的碱基片段为CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。

2.根据权利要求1所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于步骤一中大豆根表面的清理及灭菌的具体步骤为：用自来水冲洗大豆根表面土壤，滤纸吸干，按照以下顺序处理：无菌水冲洗3次，体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡3min，体积浓度为2.5％次氯酸钠溶液浸泡3min，体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干。

3.根据权利要求1所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于步骤四中第一次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸8min，4℃保温。

4.根据权利要求1所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于步骤五中第二次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，前14个循环为94℃变性1min，68-55℃复性45s，72℃延伸1min，其中每个循环后复性温度下降1℃，后16个循环为94℃变性1min，55℃复性45sec，72℃延伸1min；最终72℃延伸8min，4℃保温。