[发明专利]一种检测 ERCC1 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法无效
申请号: | 201210521367.9 | 申请日: | 2012-12-07 |
公开(公告)号: | CN103088123A | 公开(公告)日: | 2013-05-08 |
发明(设计)人: | 张伟;郭成贤;陈小平;刘昭前;周宏灏 | 申请(专利权)人: | 周宏灏 |
主分类号: | C12Q1/68 | 分类号: | C12Q1/68 |
代理公司: | 长沙正奇专利事务所有限责任公司 43113 | 代理人: | 卢宏 |
地址: | 410078 湖南省长沙市开*** | 国省代码: | 湖南;43 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 检测 ercc1 mrna 基因 表达 试剂盒 方法 | ||
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种检测 ERCC1 mRNA 基因表达量的试剂盒及方法。
背景技术
铂类药物是最常用的肿瘤化疗药物之一,包括顺铂、卡铂和奥沙利铂等。其药理学机制主要是通过引起肿瘤细胞内 DNA的交联,阻碍DNA 合成与复制,从而抑制肿瘤细胞的生长。DNA修复是铂类药物耐药性产生的主要原因。ERCC1(excision repair cross complementation 1,切除修复交叉互补基因1)是核苷酸外切修复家族中的重要成员,参与DNA链的切割和损伤修复过程。ERCC1表达量直接影响DNA的修复。
ERCC1在所有的肿瘤细胞中都存在表达,而且表达水平差异很大。临床研究已证实ERCC1参与铂类药物耐药的发生,其表达水平与多种肿瘤铂类药物化疗的疗效和生存期呈负相关 (Olaussen KA et al.N Engl J Med.2006; 355(10): 983-91.) ,即表达水平低的患者对铂类药物敏感,反之表达水平高的患者则耐药。美国国家综合癌症网络(NCCN)临床实践指南(第二版,2010)中明确指出:在接受铂类药物化疗前进行ERCC1基因水平的表达检测 (NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology for NSCLC.V2.2010.) 。
荧光定量PCR技术的出现,为本发明提供了一种操作简单快速、易标准化、检测费用低,准确可靠、定量检测mRNA的方法。通过该方法可以快速检测肿瘤细胞 (来源于肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等) 中ERCC1 mRNA的表达量,用于临床医生对铂类的合理化使用。
发明内容
本发明旨在提供一种检测 ERCC1 基因mRNA表达量的荧光定量PCR检测试剂盒及方法,能简单快速、准确可靠的检测ERCC1基因。
为了达到上述目的,本发明提供的技术方案为:
一种检测ERCC1基因表达量的荧光定量PCR试剂盒,包含以下组成部分:
(1)ERCC1基因标准品:含有ERCC1基因编码序列的重组载体,所述ERCC1基因编码序列如SEQ ID NO.1所示;
(2)检测ERCC1 基因的上、下游引物:
ERCC1-上游引物:5’- TGTCCAGGTGGATGTGAAAG -3’(SEQ ID NO.2)
ERCC1-下游引物:5’- GAGGATCAATGTGCAGTCGG -3’(SEQ ID NO.3)
进一步,所述含有ERCC1基因编码序列的重组载体的空载体为pUC57载体;
进一步,该试剂盒还包含逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液、M-MLV逆转录酶、定量PCR缓冲液和TaqDNA聚合酶。
所述逆转录缓冲液为常规逆转录缓冲液,如5×逆转录缓冲液 (有浓度为50mmol/L、pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L的KCl、浓度为4 mmol/L的MgCl2和浓度为10mmol/L的二硫苏糖醇DTT组成) 等;所述逆转录引物 Oligo-(dT) 为寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸;所述 dNTPs 溶液为 dATP (脱氧腺苷三磷酸) 的混合水溶液;所述定量 PCR 缓冲液为常规定量 PCR 缓冲液,如5×定量 PCR 缓冲液 (由浓度为10mmol/L,pH为8.0的Tris-HCl、浓度为50mmol/L 的 KCl 和浓度为2 mmol/L的 MgCl2 组成) 等。
本发明还提供了基于上述试剂盒检测 ERCC1 mRNA 基因表达量的方法,包括以下步骤:
(1)从待测标本 (肿瘤组织、循环肿瘤细胞、穿刺标本、胸腹水等) 中提取细胞总RNA,测定RNA浓度,加入逆转录缓冲液、逆转录引物Oligo-(dT)、dNTPs溶液和M-MLV逆转录酶,将RNA逆转录为cDNA;
(2)分别将已知拷贝数的ERCC1基因标准品倍比稀释至108、107、106、105、104、103、102、10个拷贝数/μl;
(3)分别以步骤(1)所制备的待测cDNA及步骤(2)倍比稀释的ERCC1基因标准品为模板,加入检测ERCC1基因的上、下游引物,定量PCR缓冲液,dNTPs溶液以及TaqDNA聚合酶,进行荧光定量PCR;
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